זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים
Summary
זיהוי מדויק של תאים הלוויין חיוני ללמוד את הפונקציות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לזהות תאים הלוויין במקטעי שרירי השלד למבוגרים מאת מבוססי immunofluorescence מכתים.
Abstract
Immunofluorescence היא שיטה יעילה המסייעת לזהות סוגי תאים שונים במקטעי רקמות. ללימוד האוכלוסייה התא הרצוי, נוגדנים עבור תאים מסוים סמנים מוחלים על רקמות חלקים. בשרירי השלד למבוגרים, תאי לוויין (SCs) הם תאי גזע שתורמים שריר תיקון והתחדשות. לכן, חשוב להמחיש ולאתר האוכלוסייה בלוויין תא בתנאים פיזיולוגיים שונים. נח שרירי השלד, SCs שוכנים בין הנדן הבזליים קרום פלזמה myofiber. סימן נפוץ לזיהוי SCs את myofibers או תרבית תאים הוא החלבון לזווג תיבת Pax7. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence Pax7 אופטימיזציה במקטעי שרירי השלד מוצג זה ממזער שאינם ספציפיים מכתים ורקע. עוד נוגדן מזהה חלבון (laminin) של הנדן הבזליים נוספה גם כדי לסייע בזיהוי SCs-בדומה פרוטוקולים יכול לשמש גם כדי לבצע כפולים או משולשים תיוג עם Pax7, נוגדנים חלבונים נוספים של עניין.
Introduction
שרירי השלד הוא מורכב של תאי שריר multinucleated, הנקרא myotubes, המסודרות myofibers, המניבות כוח ותנועות דרך ציר. שרירי השלד ביותר, למעט כמה שרירים ואסטתיים, נגזרות מבנה עובריים זמני בשם somite1. קודמן myogenic תאים delaminate מ somite אפיתל להפוך myoblasts. Myoblasts נוספות להבדיל לתוך השריר כי הפתיל כדי להפוך myotubes כדי ליצור myofibers רב nucleated. התהליך הנ ל נקרא myogenesis והוא מאופיין על ידי מוסדר חנותם בקרת ביטוי גנים. מבשרי myogenic אקספרס Pax3 ו- Pax7, ואילו myoblasts אקספרס אלוהים ו/או Myf5 ונייטרלים אקספרס2,myogenin ו- myosins3. השריר הוא תהליך שבו myofibers להיות גדולים יותר על ידי שילוב myonuclei יותר קיימים סיבים (היפרפלזיה) ועל ידי עלייה סיבי השריר (היפרטרופיה) בגודל4. במהלך השריר, יש מקור בר-קיימא של תאי myogenic יש מאפייני תא גזע בכך שהם יכולים להבדיל ולחדש את עצמי. תאים אלה מכונים תאי לוויין לפי מיקומם הפיזי בין הנדן הבזליים5sarcolemma (קרום התא של myofiber). SCs נמרצות לתרום לצמיחה שרירים על הבמה לנוער (2-3 השבועות הראשונים של עכברים כמחנכת), אבל להיות השבתה הדרגתית ב נח שריר למבוגרים6. למרבה הפלא, הם יכולים להיות מופעל מחדש בתגובה שריר פצעה, להבדיל לתוך תאי שריר חדשים כדי לתקן את השריר הפגוע7.
מאפייני תא גזע לבצע חקר SCs הרלוונטיים עבור שריר בסיסיים בביולוגיה והן טיפולים של מחלות שריר8. כתוצאה מכך, עבר שטח של חקירה אינטנסיבית בעשורים האחרונים. התקדמות עצומה נעשתה בניתוח את הגנטיקה ואת אפיגנטיקה SCs9,10. מעורב בידוד וזיהוי SCs בחיי עיר היו שפותח וטכניקות אופטימיזציה לאורך הדרך11. צביעת immunofluorescent מאפשר זיהוי SCs באמצעות נוגדנים ספציפיים, כולל זה עבור Pax7. עם זאת, המחסור ואת גודל קטן של ה-SCs בשילוב עם auto-פלורסצנטיות חזקה של רקמת שריר השלד למבוגרים לדקלם את הפריט החזותי מאתגר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent הממוטבות עבור העכבר שריר Pax7, המבוסס על שיטה קיימת עבור דג זברה שריר12. בנוסף, נוגדן Laminin המסומנת fluorophore ברורים הוא מועסק כדי לזהות הנדן הבזליים שתחתיו ה-SCs ממוקמים. פרוטוקול זה מאפשר באופן עקבי את החזיית SCs Pax7-חיובית, מבשרי myogenic תחת כל נבדק בתנאים פיזיולוגיים ושלבים התפתחותיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנ ל מבוססת על שיטה של Pax7/MF20 מכתים על שרירי השלד דג זברה12. הפתרונות בשימוש וחסימת צעדים הן זהות או דומות. הנוגדנים בשימוש זהים. השלבים מנוכי עונתיות התבססו על התכונות של רקמת שריר עכבר ו- SCs. ראשית, Laminin נוגדן נוסף בתערובת שיעזרו להמחיש, לאשר את המיקום של SCs. זה היה מועיל …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים NIAMS אור הדמיה המקטע למתן מיקרוסקופים וסיוע טכני. נוגדנים MF20 ו- Pax7 התקבלו מהבנק התפתחותית מחקרים ליפידים שפותח תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי העירייה במחלקה למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת איווה, איווה. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר מחקר התוכנית של NIAMS של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
