Summary
ここでラットのポータル高血圧症候群を特徴付けるために門脈圧、内臓の血流、血行などの循環パラメーターの侵襲的な測定のための詳しいプロトコルについて述べる。
Abstract
これは、ポータルの高血圧症候群の特性評価のための肝硬変ラットにおける侵襲血行動態測定を記述する詳細なプロトコルです。肝硬変による門脈圧亢進症 (PHT) は肝疾患の最も重篤な合併症を担当です。ポータル高血圧症候群の全体像は、肝内血管抵抗 (IHVR) の増加、胃壁の循環、内臓の血流増加による増加ポータル圧力 (PP) が特徴です。進歩的な内臓動脈の血管拡張や高い心拍数 (HR) が低の動脈圧と心拍出量の増加ポータル高血圧症候群の特徴です。
新規治療法は現在、いずれかのターゲット IHVR で PP を減らすことを目指すを開発されているまたは内臓の血流を増加-全身の血行動態に対する副作用が発生します。静脈、内臓、ポータルと全身血行動態的パラメーターの詳細な特性解析は、PP、門脈血流量 (PVBF)、上腸間膜動脈の血流、平均動脈圧 (地図)、および HR の測定を含めたに必要なため、前臨床PHT 新たな治療法の有効性の評価。私たちのビデオの記事は、肝硬変ラットにおける侵襲血行動態計測を実行するための構造化されたプロトコルを持つリーダーを提供します。特に、大腿動脈と回盲部静脈を介して門脈カテーテルおよび静脈のポータルの測定について述べるし、内臓の血流の血管ドップラー超音波流れプローブを介して。PHT の異なるラット モデルの代表の結果が表示されます。
Introduction
PHT は静脈瘤出血、腹水1など肝硬変患者の重篤な合併症を引き起こす可能性が、門脈系の病理組織学的に高められた血圧として定義されます。一方、(例えば、門脈血栓症) 前の肝と後肝 (例えばバッド ・ キアリ症候群) PHT はまれ、肝硬変による肝内 PHT PHT2の最も一般的な原因を表します。
肝硬変、PP は主に高架の IHVR3の結果として増加します。高度な段階で PHT は、心拍出量の増加により増加の PVBF によって悪化、全身や内臓の血管抵抗を減少-ポータル高血圧症候群4を定義します。オームの法則 (ΔP = Q * R) IHVR と血流が PP5に比例していることを意味します。患者では、PP の直接測定、危険なない日常的に行われます。代わりに、肝静脈圧力勾配 (化する) は、PP6、7の間接的な指標として使用されます。化するは、肝静脈8は、バルーンカテーテルを使用して測定されるくさび肝静脈圧 (WHVP) から無料肝静脈圧 (FHVP) を減算することによって計算されます。生理化する範囲 1-5 mmHg、間、化する ≥10 mmHg 臨床的に重要な門脈圧亢進症 (CSPH) を定義し、食道静脈瘤出血、腹水、肝性脳症9 など、PHT 関連の合併症のリスクの増加を示す.PP (すなわち化する) は PHT の重大度、PHT の他のコンポーネントに関する情報の最も関連するパラメーターが胃壁循環 (HR、マップ) の重症度を含む内臓/腸間膜血流と IHVR、ために欠かせないPHT の異なる機構の包括的な理解を得る。
したがって、人間の PP の間接測定と対照をなしてラットの導入方法論は PP の直接測定の利点を提供、ポータル高血圧症候群追加血行動態パラメーターの録音が可能します。さらに、PP の直接測定は、肝線維症 (IHVR の主要な決定要因) の量の優れた統合読み出しと肝組織標本誤差に関連線維症の定量化の特定の限界を克服します。
手術胆管結紮 (BDL)、毒素誘起肝障害 (すなわち、四塩化炭素、チオアセトアミド、またはジメチルニトロソアミン管理によって)、食事誘発代謝肝臓などの肝硬変 PHT の最も一般的に使用される齧歯動物モデル疾患モデル。肝 (非硬変) PHT は部分的門脈結紮 (PPVL)10によることができます。
小さい齧歯動物はマウス、ハムスター、ラットまたはウサギを含む、提案手法に適して、比較的低いメンテナンス コストに関連付けられています。それにもかかわらずラットまたは動物のサイズの利点のための大きい齧歯動物で血行動態の評価はマウスより良い精度と再現性で実行することは不可能、すべて見られています。また、特定のマイクロ機器および装置は、マウスと同様の血行動態パラメーターを取得する必要です。最後に、ラットは、下の関連する罹患率と死亡率をより強固としたがって、ドロップ アウト率が低い群に比べてマウスの可能性が高い。
説明されている方法は (すなわち、抗線維化または抗炎症薬) 肝臓の病気の特定の治療法の評価に適してまたはその影響血管緊張や内皮細胞生物学の新規薬理学的アプローチPHT のしたがって、可能性があります効果血行動態パラメーター。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、ウィーン医科大学と科学、研究および経済 (BMWFW) のオーストリアの大臣の倫理委員会によって承認されています。手術室の無菌条件で行われた、または同様の手順する必要があります作業区域をきれいに血行動態の測定は、外科的介入を表すため。一般的に、無菌状態で作業することをお勧めします。吸入麻酔を使用する場合は、作業の安全のため手術室の十分な換気を検討してください。40-50 分の期間/動物はこのプロトコルですべての血行力学的読み出し場合に考慮すべき。
1. 術前準備
- オンにし、製造元の指示に従って圧力トランスデューサーを含む電子マルチ チャンネル レコーダーを調整します。
- 超音波流量プローブ (1 mm と 2 mm) をブリッジ アンプに接続します。
- 滅菌生理食塩液、体温、37 ° C、ティッシュかガーゼ湿布を潤しに加熱の貯水池を準備します。
- 麻酔の重量調整と体重によると血行動態パラメーターの正規化を提供する動物の体重を記録します。
- 吸入麻酔のためのすべての機器を準備します。
注: 吸入麻酔および/または必要な機器がサイトではなくまたは不可能の場合、注射麻酔のケタミン ・ キシラジンを使用して使用できます (80-100 mg/kg ケタミン生理食塩液、腹腔内で 5-10 mg/kg、キシラジンと (i. p.))。30-45 分後にケタミン (低用量の 20-30 mg/kg 筋肉内 (イオ ミン)) の再投与は、連続平面外科麻酔を誘導するために必要です。 - 誘導ボックスを用いた吸入麻酔短期のイソフルラン麻酔下の動物を置く (5 分、5 %v/v イソフルラン、3-4 L O2-の流れ)。慎重に箱を傾けて、動物の不動状態で麻酔の深さを確認してください。
-
適当な自作気管内チューブとラットを挿管します。
注: 挿管技術に新しい担当者にとって鎮痛/麻酔 (ステップ 1.10) 指定できます短期吸入麻酔直後後挿管のための余分な時間を許可します。別のオプションは、吸入麻酔動物固有フェイス マスクです。- 変更された末梢静脈カテーテル (14 G) から自作の気管内チューブを使用します。処理翼を切断し、気管内チューブ (図 1 a) の転位を防ぐためにラットの頬に後方固定用粘着テープ ・ ループを貼る。
- ガイド ワイヤ ホルダーと適切な鈍い先端ワイヤー (図 1 b) として変更された動脈カニューレから自作ガイド ワイヤ デバイスを使用します。
- 動物の適切な位置に適切な挿管デスクを使用します。斜めの位置に頭で仰臥位に動物を配置します。
注: 挿管デスクが利用できない場合、仰臥位で慎重にテーブルの端に伸びる首に動物を配置することが可能です。ただし、この手順は傷害の高められた危険のため推奨されません。 - ラットの一側の門歯の後ろに縫合を修正し、ゆっくりと反対側 (図 1) 縫合糸を結ぶことによって動物の首を伸ばします。
- 集中光ビームによる気管前腹側の襟の領域を照らします。特にアルビノ動物の声帯が改善された可視化と迅速な挿管を可能にするために皮膚を通して照らされることを確認します。
注: は、色素性の動物の挿管動物固有の喉頭鏡を使用します。 - 舌をつかむし、2 本の指を使用して静かに引き出します。
- 慎重に喉頭領域の麻酔にリドカイン (ポンプ スプレー) によって扱われる綿棒を使用します。
- 声帯とはガイド線装置 (図 1) のサポートを使用して気管に気管内チューブを挿入することによって動物を挿管します。
- ガイド ワイヤ デバイスを取り外します。
- 人工呼吸器のチューブを接続します。
- 動物のための適切な設定を使用して人工呼吸を開始 (1 L/min O2-の流れ、フローの自動 = 90/分; 吸気圧力: 18 mmHg;のぞき: 3 mmHg、私/E = 1:2) と適切な挿管を確認します。
注: 胃の膨張が認められる場合チューブを削除し、もう一度やり直してください。また、呼吸リズムに呼吸活性を比較したり、腹部壁に 2 本の指を置き、右の胃の潜在的なインフレ率を評価するために胃の上。
- 0.5-1.0 のイソフルラン麻酔を開始 %v/v と 1 L/min O2-成功した挿管 (図 2 a) の直後に流れます。
- 頬とチューブの貼付の粘着テープのループを介して transbuccal 縫合によって気管内チューブを修正します。
- 追加の麻酔と注射器 1 mL 2 本、例えばケタミン (100 mg/kg) i. p. (23 G カニューレ) [やで尾側大腿筋 (30 G カニューレ) 二国間の注射で噴射量 (線量) を配布することでイオ ミン] 鎮痛管理と piritramide (2mg/kg 皮下皮下注射 (23 G カニューレ)。イオ ミン注射注射部位 (図 2 b) あたりの最大音量に注意してください。
- 眼軟膏を適用します。腹部や太ももの内側両方に体の毛をクリップします。皮膚を消毒します。
注: 両方の太ももの内側は、片側大腿動脈のカテーテル検査が失敗した場合に備えて、HR や地図計測対側の大腿動脈使用を許可する剃られるべき。シェービング後の時点では、手術野を汚染する髪を引き起こす可能性があります。 - 粘着テープ (図 2) で加熱パッド (38 ° C) に仰臥位で動物を固定します。
- 動物の継続的に、例えば体の温度を監視するには、直腸温度プローブ (図 2 D) を使用します。
- 眼瞼閉鎖反射とつま先、ピンチ、テストの介入や手術前に、麻酔の深さを評価します。
2 HR と地図の測定
- ティッシュ鉗子で皮膚を持ち上げることによって大腿動脈の推定位置の上の太もも (選択の 1 つの側面) の内側の皮膚を切開し、約 2 cm の皮膚領域を削除するメイヨーの長さをはさみ (図 3 a)。
- 公開そしてぶっきらぼう複合体に沿って止血を繰り返し開いて、結合組織 (外膜) から大腿動脈を含む動脈静脈神経複合体を解剖します。
- ~1–1.5 cm (図 3 b) に沿って周囲の組織から動脈静脈神経複合体を解剖します。
- 必要に応じてより良いビューの郭清/血管周囲の皮下脂肪を削除します。
注: は、負傷した血管が出血を引き起こす可能性がありますのでキューティクル シザーで/血管周囲の皮下脂肪を削除する注意してください。出血が認められる場合は、小さなガーゼを使用して出血領域の圧力を適用または、止血して出血を止めます。 - 2 高精度 45 ° 角度広いポイント鉗子で大腿静脈と神経から大腿動脈を分離 (最も内側の構造体は、大腿静脈、大腿動脈があるを考慮するより外側) (図 3-F)。
- できるだけ、遠位大腿動脈に合字を配置し、大腿動脈に優しい縦トラクションを適用する縫合に湾曲したクランプを使用します。
- として、近位の大腿動脈に 2 番目 (閉じられていない結び目) が、あらかじめ結び目縫合を配置できる (図 3)。
- ヘパリン滅菌生理食塩液 (5 mL シリンジと 23 G 鈍カニューレ) フラッシュ傾斜 (~ 45 °) カットオフ ヒントで適切なカテーテル (ラット大腿動脈の PE-50) を準備します。気泡内がないカテーテル動脈圧と HR 読み出し (図 3 H) を妨げるようを確認します。
- 大腿動脈 (図 3 i) の動脈の血流を一時的に停止するマイクロ クランプを使用して露出した部分の近位端を圧縮します。
- 大腿動脈 (図 3J) の下にサポート マイクロ金属ヘラを配置しながら曲がってカニューレ (23 G) を使用して切り裂かれたセクションの場所で遠位の動脈の壁に穴を開けます。
- 慎重に上向きのカテーテルの先端の傾斜で穿孔を通して大腿動脈カテーテルを入れて下さい。事前マイクロ クランプまでカテーテル近似 (図 3 K)。
注: 最初の試行で大腿動脈の失敗したカテーテルの場合より近位の 2 番目の試み実行できます (ステップ 2.8 で開始)。動脈破裂または出血が発生した場合結紮またはとしてさらに血損失を防ぐために可能な限り近位の動脈をクランプします。血液の損失は最小限場合と対側の大腿動脈を catheterizing (2.1 のステップに開始)。 - マイクロ クランプを開き、カテーテル (図 3 L) に拍動性血流を確認します。
- さらに防ぐ血の流入、カテーテルにカテーテルの流出をブロックすることによって。
- 腔内の場所にカテーテルを大腿動脈周辺 (図 3 M) の導入のカテーテル準備の近位合字を閉じることによって修正します。
- 繰り返し洗浄し、適切な血管内の配置を評価するために大腿動脈にカテーテルを吸引します。吸気血の列に動脈の脈動は容易に注目すべき。
- 脱臼を防ぎカテーテル (図 3 n) の縦方向の位置を維持する遠位の合字の両端を使用して容器に沿ってカテーテルの位置を修正します。
- さらに、それをセキュリティで保護し、偶発的な転位を防ぐために手術台に動物の近くにカテーテルをテープします。
- 満ちている圧力トランスデューサーを生理食塩液、気泡の形成を回避しながらカテーテルを接続します。
- 人事・ デジタル インターフェイス (図 3O) を使用して、マップの記録を開始します。
- 小さな湿らせたガーゼ湿布 (図 3 P) と太ももの内側に露出している領域をカバーします。
- 胃壁 (HD) 指数を計算する: HD マップ/HR の =。
メモ: 高度な PHT HD インデックスは非ポータル高血圧動物と比較して高架です。しかし、手術中に HD インデックスの増加がまた出血、採食や痛みあります。記録マップ値が非常に低いが、信号が良いとカテーテル内の拍動流が検出されると、麻酔のレベルを確認し、麻酔を低下させる可能性があります。イソフルラン麻酔は、これは動物福祉と科学の実践によると十分な麻酔深度につながる可能性がありますので完全に停止しません。
(3) 上腸間膜動脈の血流 (SMABF)
-
正中開腹 (図 4 aC) を実行します。
- 組織鉗子でスキン層を持ち上げて、剣までアルバに達すると剣と、マヨを使用して皮膚の薄いストリップが白線上はさみ削除下 5-6 cm。
- 白線に沿って組織鉗子で筋層を持ち上げて皮膚切開、途中でアルバ腹壁や内臓器官の間隔を作成します。
- リネアでメスで腹壁を切開して腹腔内を開くアルバ。白線に沿って Metzenbaum シザー ティッシュ鉗子で腹壁を持ち上げながら開口部を拡張スキン層と同じ距離以上のアルバ。
- 慎重にウェット綿棒を使用して、移動性盲腸から小腸を発掘し、切開 (図 4-F) の横にある滅菌生理食塩液に浸した大きなガーゼ湿布の上に置きます。
- ガーゼ湿布に腸をラップし、それは、滅菌生理食塩液 (図 4) 湿めるかどうかを確認します。
- 検索し、上腸間膜動脈を公開します。
- 2 自作鈍 'Schwabl' と上腸間膜動脈の解剖-フック: 最初のフックと動脈を持ち上げ、同じ組織トンネルを抜けて 2 つ目を配置してみてください。周り (図 4 HK) 流プローブ (1 mm) を配置できるように 5 mm の距離に沿って上腸間膜動脈を公開します。
注: 優先、精度 45 ° 角度広いポイント鉗子が同様の動脈を解除する使用できます。'Schwabl'-フックは、フック形に曲げるぶっきらぼう壊れたのヒント 30 G カニューレから用意されています。担保動脈が広範囲場合、'Schwabl'-フック上腸間膜動脈の解剖を避けることができるしながら担保から出血として安全であるかもしれない。上腸間膜動脈を準備している間の出血が発生した場合は、穏やかな圧力と 1-2 分のため出血のサイトに小さなガーゼ湿布を配置します。すぐに通常停止小出血常に組織は定期的に (ステップ 1.12) 湿めることに留意してください。上腸間膜動脈自体に問題がある場合は、血行動態の評価が終了する必要があります。 - 超音波流量プローブのセンサーに超音波ゲルを適用し、内臓の腸間膜動脈に結び付けます。上腸間膜動脈 (図 4L M) の自然なルートをそれに合わせます。
- フロー プローブ (1 mm) を閉じて、そっと必要な場合は信号の品質を改善するためにドップラー センサーの追加超音波ゲルを適用します。超音波ゲルと鈍い先端カニューレ (18 G) (図 4 n・ O) 注射器 (20 mL) を使用してこれを行います。
注: 容器の自然なコースに沿ってフロー プローブを十分に揃っていない場合は、血管狭窄、したがって、乱流は、流量測定の精度で緊張可能性があります。容器の自然なルートに沿って流プローブの方向を再調整し、十分に適切な位置にフロー プローブを修正しようとします。 - SMABF を測定して大腿動脈記録の収縮ピークに拍動流信号との一致を評価します。
注: 記録されたマップ値が非常に低いが、信号が良いの拍動流が検出された場合、カテーテルは麻酔のレベルを確認、麻酔を低下させる可能性があります。これは動物の福祉と科学的な実践によると麻酔の不十分な深さにつながる可能性がありますのでイソフルラン麻酔は完全に停止しません。 - フロー プローブ (1 mm) の安定した位置を探し出し、流プローブのケーブルを修正します。さらにフロー プローブ (1 mm) (図 4 P) の操作なし SMABF を録音を開始します。
4. PVBF
- 検索し、門脈肝門部 (図 5 a) の近くにある腸間膜の背側の顔を公開します。
- 高精度 45 ° 角度広いポイント鉗子を使用して周囲の組織から門脈を優しく解剖: ゆっくりと繰り返し押すこと (図 5 b) 組織トンネルを作成する門脈下鉗子によって門脈を分離します。
注: periportal 組織から門脈の準備中に発生した出血出血; 綿棒を使用して 1-2 分敷地穏やかな圧力を適用します。これは多くの場合出血を停止します。 - 高精度 45 ° 角度の広いポイント鉗子をゆっくり開くことによってトンネルを拡大し、血管周囲流プローブ (2 mm) (図 5D) の配置を許可するように 5-6 mm の距離に沿って門脈を公開します。
- 超音波流量プローブのセンサーに超音波ゲルを適用し、その自然なルート (図 5E) 揃えて門脈に結び付けます。
- 前述 (ステップ 3.7) として必要な場合追加超音波ゲルを適用して、フロー プローブ (2 mm) を閉じます (図 5 階)。
- フロー プローブ、非収縮性門脈 (図 5) 逆に配置されますを確認します。
注: 容器の自然なコースに沿ってフロー プローブを十分に揃っていない場合は、血管狭窄、したがって、乱流は、流量測定の精度で緊張可能性があります。容器の自然なルートに沿って流プローブの方向を再調整し、十分に適切な位置にフロー プローブを修正しようとします。 - フロー プローブ (2 mm) の安定した位置を探し出し、流プローブのケーブルを修正します。その後、PVBF (図 5 H) の記録を開始します。
注: 記録されたマップ値が非常に低いが、信号が良いの拍動流が検出された場合、カテーテルは麻酔のレベルを確認、麻酔を低下させる可能性があります。これは動物の福祉と科学的な実践によると麻酔の不十分な深さにつながる可能性がありますのでイソフルラン麻酔は完全に停止しません。
5. PP
- (約 45 °) の傾斜とカテーテル (ラット腸間膜静脈の PE-50) の準備がフラッシュ滅菌生理食塩液 (5 mL シリンジと鈍 23 G カニューレ) カットオフ ヒント。気泡内がないカテーテル PP 読み出し (図 6 a) を妨害して注意を払います。
- 濡れた手袋、それは指 (図 6 b) に散在している場所と腸を処理します。
- (図 6) 小腸に近い腸間膜の血管床のビューを最適化します。
- 門脈 (静脈 ileocolica - 下大静脈物質スペリア - 下大静脈 portae) につながる主な静脈腸間膜血管を識別します。
- カテーテルのアクセスは回腸結腸静脈の適切な接合を見つけます。
- 最初組織の腸間膜に穿孔、腸間膜の臓側腹膜に近い血管の接合カテーテルの選択によってカテーテルをスティックします。
- 容器の接合部のわずかな印象が見られるまで慎重に回盲部静脈の接合部に近いカテーテルの傾斜した先端を進む (図 6)。
- 血管の交差角度で血管壁の穿孔による接合の船ルートに沿って静脈系カテーテルを入れて下さい最後に。(図 6 e)。
注: 回盲部の静脈のカテーテル法での出血で、親指のプレスを使用して出血領域で小さなガーゼ湿布と。この圧力は、出血を止めるに 1-2 分間、維持しなければなりません。その後、回盲部静脈のより近位の支店でカテーテルを挿入しようとします。 - カテーテルを進める門脈静脈 (図 6 f) 穿孔せずに主な静脈血管ルートに沿って慎重にさらに。
注: は、門脈流量信号内のアーティファクトを避けるために、門脈の穿孔を防ぐための主要なブランチの周りに配置フロー プローブに十分な距離でカテーテルをしてください。 - 満ちている圧力トランスデューサーを生理食塩液、気泡の形成を回避しながらカテーテルを接続します。
- PP の記録を開始します。
- 同時にいくつか分 (図 6H) 安定した条件の下ですべての血行動態的パラメーターを記録します。必要に応じて、代わりに組織接着剤を使用してポータルの静脈カテーテルを固定ことができ、腸を腹腔内に再配置できます。
注: 記録されたマップ値が非常に低いが、信号が良いの拍動流が検出された場合、カテーテルは麻酔のレベルを確認、麻酔を低下させる可能性があります。これは動物の福祉と科学的な実践によると麻酔の不十分な深さにつながる可能性がありますのでイソフルラン麻酔は完全に停止しません。
6. IHVR
- 動物を犠牲にすることの後に、肝臓重量を測定します。IHVR を計算する: IHVR = PVBF/頁は正規化 PVBF、この値に肝臓の重量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
動物モデルと肝疾患の重症度、に応じて PHT の度ポータル高血圧症候群の重症度は、異なる (図 7)。
BDL モデルは、胆汁うっ滞による胆汁性肝硬変を引き起こします。したがって、PP 増加時間と、胃壁の循環を開発し、HR の増加と減少の地図で見られるように。肝硬変動物、SMABF、PVBF、IHVR も的外れに増資肝と血行動態の変化 (図 7 a-F)
対照的に、PPVL により、非硬変肝の PHT PP の即時増加し全身の血行動態の変化によって特徴付けられる (図 7-私)。ただし、経門脈中に担保を開発これは PP を下げる可能性があります。
Sham 動物の血行動態の値は、生理学的なレベルでは、時間をかけて大幅に変更しないでください。健康など動物の門脈圧は最大の 6 に 5 mmHg (図 7J L) です。
図 1: 自作気管挿管デバイス:(A) 気管内チューブ。(B) ガイドはワイヤー デバイス (C) 挿管デスクです。(D) 管はガイド ワイヤ デバイスに接続されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 術前準備:(A) 動物の挿管。(B) 筋肉と皮下注射麻酔。動物の暖房のマットの固定を (C)。(D) 置くと直腸温度プローブを固定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 心拍数 (HR)、平均動脈圧 (地図):(A) 皮膚切開をします。(B) 準備、大腿の血管と神経の構造。(C-F)大腿動脈解離。(G) 遠位縫合、固定 - 近位前近位縫合糸を結び目。(H) 大腿動脈カテーテルの準備。(私) 血管マイクロ鉗子の配置。(J) 穿孔曲げ針で大腿動脈。大腿動脈のカテーテル治療 (K)。(L) マイクロ クランプ パルスの評価のための開口部。(M) 近位カテーテル固定。(N) カテーテルの遠位固定。(O) 測定の地図と時間 (P) を浸した小さなガーゼ外科分野をカバーを圧縮します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 優れた腸間膜動脈血流 (SMABF):(A-C)術を施行しました。(D) 移動性盲腸の発掘。(E-F)腸の発掘。浸したガーゼ湿布で腸のラップを (G)。(H-K)鈍カニューレ フックと内臓の腸間膜動脈の準備。(L, M)フロー プローブの添付ファイル。超音波の (N) アプリケーションにジェルが流れプローブ センサー。(O) の正しい '非収縮性' 配置、フロー プローブの。(P) SMABF の測定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 門脈血流量 (PVBF):(A) 最適化された背観門脈 (B) 腸間膜の脂肪質のティッシュから門脈の解剖。門脈血流プローブの組織トンネルを作成する (C)。(D, E)門脈に流プローブの添付ファイル。超音波の (F) アプリケーションにジェルが流れプローブ センサー。(G) 流プローブの正しい '非収縮性' 配置。PVBF を測定する (H)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 門脈圧 (PP):(A) カテーテルの準備。(B) 腸の準備。(C) 最適化をメインの上腸間膜静脈の血管に表示します。(D) 穿孔臓側腹膜とカテーテルに適した近い血管分岐の進歩。(E) 主枝と側枝の接合角度で回盲部の静脈のカテーテル法。肝門部に近い門脈にカテーテル先端部の (F) 進出。(G, H)PP. の測定この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 代表結果:(A) PP、(B) マップ、および BDL ラット (C) HR の時間コース。したがって、(D) SMABF (E) PVBF ・ IHVR (F) の変化が観察されます。PPVL で PP (G)、(H) マップ、および (私) HR の血行動態が手術後初期に最も顕著します。健康的な偽手術 (従って) 動物 (J) PP (K) 地図と (L) HR 生理値内に残っている、時間の経過とともに変更しないでください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PP はポータルの高血圧症の評価のための主な成果パラメーターで、基になる肝硬変の重症度を反映しています。マトリックス法 (すなわち、線維症) と正弦波の収縮 (ために血管収縮薬の肝の発現を増加および血管拡張薬に対する反応性の低下) を引き起こす増加 IHVR。複数の臨床11,12,13,14と臨床15,16, PP と慢性肝疾患への影響の重要性が示されています。17,18します。 したがって、肝硬変症患者の PP は難しい結果パラメーターとその軽減、治療のガイドライン19、20 、現在の肝臓の主な研究目的によって推奨されています。包括的な動物モデルを特徴付けるし、PHT22の16,21新しい治療オプションに変換が必要です。このプロトコルは、門脈圧、胃壁循環、内臓の血管拡張、肝内性の評価を含む詳細な血行動態評価に必要な方法論を提示します。代表および齧歯動物モデルから完全血行動態のデータ セットを達成するために経験と実行する演算子の訓練は最も重要なは。
深刻な出血の予防と管理は、特に重要なスキルです。関心の血管のセクションの鈍的かつ正確な準備は、カニュレーション障害と重度の出血を避けるために重要です。重要な血損失、血行動態に大きな影響と PP の正確な測定を排除または実験動物の死でも結果を可能性があります。プロトコルで測定中に発生した、重大度、出血の場所を特徴付けるドキュメント出血。
注記のうち、血流を評価するために血管超音波流れプローブを使用して近似値を生成し、読み取りエラー別の容器のサイズと不適切なプローブの配置のためにさらされる可能性があります。血流と特に血流分布 (門脈体循環シャントの計算を含む) を測定する別の方法は、色の微粒子技術23です。しかし、全臓器は収穫、解散し、分析する必要があります、この省略や発現解析、組織を実行する可能性。したがって、超音波法は動物研究で '3 r' の原則をサポートしています (削減、調整、および交換) ラッセルとトリーバーチ24で。さらに、流量、色の微粒子技術時間をかけて臓器 (腸間膜血行) を統合する必要がリアルタイムでその他の血行動態パラメーターに平行内臓血流を監視する適しています。また、色の微粒子は、通常 15 μ m の直径を持つ、閉じ込められたと不動になることを避けるためにそれぞれの器官の直径の < 15 μ m 微小血管の分布が必要、かもしれない肝硬変肝臓の場合。
このメソッドの主な制限は、動物の PHT 症候群の血行動態の評価中に無意識と麻酔の状態の必要性です。最も一般的で広く使用されている注射麻酔のケタミン ・ キシラジン麻酔25,26の必要な深さを取得する 30-45 分後 redosing がかかるこれは、トラブルシューティングが必要な場合に特に時間圧力を追加します。吸入麻酔を使用して多くの利点が含まれますが、特別な装置が必要と安全規制関連揮発性麻酔薬に従わなければなりません。麻酔深度は、麻酔濃度を調整することによって手術の手順と干渉することがなく迅速に対応できます。気管内チューブは、ケタミン、換気により救済の活性化により、十分な酸素化と換気27麻酔による死の危険を低くための動物の特に後に航空を保護します。ケタミン ・ キシラジンはまだ広く使用されている低用量のイソフルラン麻酔とラット28,29は血行動態または心血管系パラメーターの変化が著しい原因ありません。
現地での経験と規制は、最先端の推奨事項と麻酔科のベスト ・ プラクティスと研究者がこれらの血行動態評価30を実行に使用される麻酔の種類を再考しなければならない継続的を提供します。今後の実験計画は、現在制限に関する一般的な麻酔を克服し、意識した動物の血行動態の評価を許可する注入無線圧力トランスデューサー、テレメトリを使用でしょう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、我々 の研究プロジェクトの中に獣医師、看護士、および彼らの継続的な支援のための生物医学研究のセンターで、動物のキーパーを感謝します。著者は、このプロトコルのすべての校閲者の重要な入力を認めます。オーストリア消化器病学会・肝臓 (ÖGGH) PS に「若手科学賞」と「シュコダ賞」TR 内科のオーストリア社会のいくつか研究資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| LabChart 7 Pro software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Software |
| ML870 PowerLab 8/30 | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Electronic multichannel recorder |
| MLT0380/D | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure) |
| ML112 Quad Bridge Amplifier | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Bridge amplifier |
| TS420 | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | - | Flowmeter module |
| Biological Research Apparatus 7025 | UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy | - | Ventilator |
| Vapor 2000 | Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany | - | Isofluran Vaporizer |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA1PRB | Ultrasonic flow probe (1mm) |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA2PSB | Ultrasonic flow probe (2mm) |
| 1st for intubation & 2nd for clean skin incisions | - | - | Mayo scissor [x2] |
| Metzenbaum scissor | - | - | - |
| Cuticle scissor | - | - | - |
| e.g. Adson Brown tissue forceps | - | - | Tissue Forceps |
| High precision 45° angle broad point forceps [x2] | - | - | - |
| Hemostat [x4] | - | - | - |
| e.g. Mikulicz peritoneal clamp | - | - | Curved clamp |
| e.g. Dieffenbach clamp | - | - | Micro clamp |
| e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm, | - | - | Micro metal spatula |
| for transbuccal suture at intubation | - | - | Needle holder |
| Scalpel grip | - | - | - |
| selfmade | - | - | Intubation desk |
| blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow | - | - | Blunt steel wire |
| modified arterial line 20G with Flowstich | Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK | #682245 | Arterial line |
| Heating pad | - | - | - |
| Rectal temerature probe | - | - | - |
| Saline heater | - | - | - |
| Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat) | - | - | - |
| Inductionbox for inhalation anesthesia | - | - | - |
| Scale (able to measure mg) | - | - | - |
| Hair clipper | - | - | - |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden | #393230 | Peripheral venous catheter (14G) |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, | Smiths Medical International Ltd., Kent, UK | #800/100/200 | Catheter tube (PE-50) |
| e.g. Omnifix-F Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #9161406V | Syringe 1mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606051V | Syringe 5mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606205V | Syringe 20mL |
| e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304622 | Cannula (18G) |
| e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #300800 | Cannula (23G) |
| e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304000 | Cannula (30G) |
| e.g. Leukoplast S | BSN medical GmbH, Hamburg, Germany | #47619-00 | Adhesive tape |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10972 | Gauze compress (small) |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10961 | Gauze compress (big) |
| Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 | SMI AG, St. Vith, Belgium | #2021-04 | Suture (Silk 4/0, EP 1.5) |
| e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany | #EH7552 | Transbuccal suture |
| e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) | Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany | #967936 | Cotton buds |
| e.g. Vue Ultrasoundgel | Optimum Medical Limited, UK | #1157 | Ultrasound gel |
| e.g. Glubran 2 | Gem srl, Viareggio, Italy | #G-NB2-50 | Tissue glue |
| e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel | Swann-Morton, England, B.S. | #202 | Scalpel Knife |
| Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) | Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria | - | Heparin |
| Florane | Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK | - | Isoflurane |
| OeloVital (5g) | Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria | - | Eye gel |
| Ketasol | aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany | - | Ketamine |
| Rompun | Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria | - | Xylazine |
| Xylocain 10% Pumpspray | AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria | - | Lidocaine pump spray |
| Dipidolor | Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria | - | Piritramide |
| NaCl 0.9% Fresenius, 1L | Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria | #13LIP132 | Physiological saline solution |
References
- Ripoll, C., et al. Hepatic venous pressure gradient predicts clinical decompensation in patients with compensated cirrhosis. Gastroenterology. 133 (2), 481-488 (2007).
- Bosch, J., Groszmann, R. J., Shah, V. H. Evolution in the understanding of the pathophysiological basis of portal hypertension: How changes in paradigm are leading to successful new treatments. J Hepatol. 62, S121-S130 (2015).
- Blachier, M., Leleu, H., Peck-Radosavljevic, M., Valla, D. C., Roudot-Thoraval, F. The burden of liver disease in Europe: a review of available epidemiological data. J Hepatol. 58 (3), 593-608 (2013).
- Colle, I., Geerts, A. M., Van Steenkiste, C., Van Vlierberghe, H. Hemodynamic Changes in Splanchnic Blood Vessels in Portal Hypertension. Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 699-713 (2008).
- Laleman, W., Van Landeghem, L., Wilmer, A., Fevery, J., Nevens, F. Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver International. 25 (6), 1079-1090 (2005).
- Franchis, R. d Updating Consensus in Portal Hypertension: Report of the Baveno III Consensus Workshop on definitions, methodology and therapeutic strategies in portal hypertension. Journal of Hepatology. 33 (5), 846-852 (2000).
- Zardi, E. M., Di Matteo, F. M., Pacella, C. M., Sanyal, A. J. Invasive and non-invasive techniques for detecting portal hypertension and predicting variceral bleeding in cirrhosis: a review. Annals of medicine. 46 (1), 8-17 (2014).
- Kumar, A., Sharma, P., Sarin, S. K. Hepatic venous pressure gradient measurement: time to learn. Indian J Gastroenterol. 27 (2), 74-80 (2008).
- Tsochatzis, E. A., Bosch, J., Burroughs, A. K. Liver cirrhosis. Lancet. 383 (9930), 1749-1761 (2014).
- Abraldes, J. G., Pasarín, M., García-Pagán, J. C. Animal models of portal hypertension. World Journal of Gastroenterology : WJG. 12 (41), 6577-6584 (2006).
- Reiberger, T., et al. Sorafenib attenuates the portal hypertensive syndrome in partial portal vein ligated rats. Journal of Hepatology. 51 (5), 865-873 (2009).
- Schwabl, P., et al. Pioglitazone decreases portosystemic shunting by modulating inflammation and angiogenesis in cirrhotic and non-cirrhotic portal hypertensive rats. Journal of Hepatology. 60 (6), 1135-1142 (2014).
- Reiberger, T., et al. Nebivolol treatment increases splanchnic blood flow and portal pressure in cirrhotic rats via modulation of nitric oxide signalling. Liver International. 33 (4), 561-568 (2013).
- Schwabl, P., et al. The FXR agonist PX20606 ameliorates portal hypertension by targeting vascular remodelling and sinusoidal dysfunction. Journal of Hepatology. 66 (4), 724-733 (2017).
- Mandorfer, M., et al. Sustained virologic response to interferon-free therapies ameliorates HCV-induced portal hypertension. J Hepatol. 65 (4), 692-699 (2016).
- Schwabl, P., et al. Interferon-free regimens improve portal hypertension and histological necroinflammation in HIV/HCV patients with advanced liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 45 (1), 139-149 (2017).
- Reiberger, T., Mandorfer, M. Beta adrenergic blockade and decompensated cirrhosis. Journal of Hepatology. 66 (4), 849-859 (2017).
- Reiberger, T., et al. Carvedilol for primary prophylaxis of variceal bleeding in cirrhotic patients with haemodynamic non-response to propranolol. Gut. 62 (11), 1634-1641 (2013).
- Reiberger, T., et al. Austrian consensus guidelines on the management and treatment of portal hypertension (Billroth III). Wiener klinische Wochenschrift. 129 (3), 135-158 (2017).
- de Franchis, R. Expanding consensus in portal hypertension. Journal of Hepatology. 63 (3), 743-752 (2015).
- Pinter, M., et al. The effects of sorafenib on the portal hypertensive syndrome in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma - a pilot study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 35 (1), 83-91 (2012).
- Schwabl, P., Laleman, W. Novel treatment options for portal hypertension. Gastroenterol Rep (Oxf). 5 (2), 90-103 (2017).
- Klein, S., Schierwagen, R., Uschner, F., Trebicka, J. Mouse and Rat Models of Induction of Hepatic Fibrosis and Assessment of Portal Hypertension. , (2017).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Langhans, W., Myrtha, A., Riediger, T., Lutz, T. A. Routine animal use procedures. , Institute of Veterinary Physiology, University of Zurich, Physiology and Behavior Laboratory, Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich. (2016).
- Animal Care and Use Program. Rat and Mouse anesthesia and analgesia: Formulary and General Drug Information. , The University of British Columbia. (2016).
- Davis, J. A. Current Protocols in Neuroscience. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Veterinary Research. 10 (1), 198 (2014).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).
- Becker, K., et al. Statement on anesthesia methodologies: Recommondations on anaesthesia methodologies for animal experimentation in rodents and rabbits. , GV-SOLAS - German veterinary association for animal welfare. (2016).
