Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação
Summary
Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.
Abstract
A família de caspase de proteases desempenham um papel essencial na apoptose e imunidade inata. Entre estes, um subgrupo conhecido como iniciador caspases são os primeiros a ser ativado nestes caminhos. Este grupo inclui caspase-2, -8 e -9, bem como as caspases inflamatórias, caspase-1, -4 e -5. As caspases iniciador são todos ativadas por dimerização seguir ao recrutamento de complexos Multiproteicos específicos, chamados de plataformas de ativação. Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é uma abordagem baseada em imagem onde dividir proteínas fluorescentes fundidas ao iniciador caspases são usadas para visualizar o recrutamento das caspases iniciador de suas plataformas de ativação e o resultante induzida por proximidade. Esta fluorescência fornece uma leitura de um dos primeiros passos necessários para a ativação de caspase iniciador. Usando um número de diferentes abordagens baseadas em microscopia, esta técnica pode fornecer dados quantitativos sobre a eficiência da ativação de caspase em um nível de população, bem como a cinética de ativação de caspase e o tamanho e o número de ativação de caspase complexos em uma base por célula.
Introduction
A família de protease caspase é conhecida por seus papéis críticos na apoptose e imunidade inata 1. Por causa de sua importância, determinar quando, onde e quanto à eficácia das caspases específicas são ativadas podem fornecer insights cruciais sobre os mecanismos de caspase vias de ativação. O protocolo baseado em imagem descrito aqui permite a visualização dos primeiros passos para a cascata de ativação de caspase. Esta técnica tira proveito das interações da proteína: proteína dinâmica ativação de caspase naquela unidade.
As caspases podem ser divididas em dois grupos: as caspases de iniciador (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e as carrasco caspases (caspase-3, -6 e -7). As caspases carrasco estão presentes na célula como dímeros pré-formadas e são ativadas por clivagem entre os grandes e pequenos subunidade 2. Quando ativado, eles cleave inúmeras proteínas estruturais e reguladoras, resultando em apoptose 3. As iniciador caspases são as caspases primeiras para ser ativado em uma via e geralmente acionar a ativação das caspases carrasco. Em contraste com o carrasco caspases, iniciador caspases são ativadas por dimerização 4,5. Este dimerização é facilitada pelo recrutamento de monômeros inativos para complexos de peso molecular grande específico conhecidos como plataformas de ativação. Montagem de plataformas de ativação é regida por uma série de interações da proteína: proteína específica. Estas são mediadas por motivos de interação de proteínas conservadas presentes no proform de caspase o iniciador e incluem o domínio da morte (DD), domínio effector da morte (DED) e de domínio (cartão) de recrutamento de caspase 6 (figura 1A). Plataformas de ativação incluem geralmente uma proteína do receptor e uma proteína do adaptador. O receptor é normalmente ativado mediante a ligação de um ligante, induzindo uma mudança conformacional que permite a oligomerização de numerosas moléculas. O receptor então também recruta a caspase diretamente ou moléculas do adaptador que por sua vez, trazem a caspase ao complexo. Assim, numerosas moléculas de caspase entram em proximidade que permite dimerização. Isso é conhecido como o modelo de proximidade induzida por 7. Uma vez dimerized, a caspase sofre de autoprocessamento, que serve para estabilizar a enzima activa 4,8. Por exemplo, montagem do apoptossomo Apaf1 é acionada pelo citocromo c após sua libertação da mitocôndria em um processo chamado de permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Apaf1, por sua vez, recruta caspase-9, através de uma interação que é mediada por um cartão presente em ambas as proteínas 9. Semelhante resultado de interações proteína na Assembleia da CD95 morte induzindo sinalização complexo (disco) que leva à ativação de caspase-8; o PIDDosome, que pode ativar caspase-2; e vários inflammasome complexos que iniciam a ativação de caspase-1 10,11,12. Assim, iniciador caspases são recrutadas para plataformas específicas de ativação através de um mecanismo comum, resultando em proximidade induzida e dimerização, sem a qual não ocorrerá ativação.
Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é um ensaio baseado em imagens que foi desenvolvido para medir este primeiro passo na ativação das caspases de iniciador, permitindo a visualização direta da proximidade de caspase induzido após a plataforma de ativação montagem. Este método aproveita-se das propriedades da proteína fluorescente divisão Venus. Vênus é um mais brilhante e mais fotoestável versão de proteína fluorescente amarela (YFP) que pode ser separada em dois fragmentos não-fluorescente e ligeiramente sobrepostos: N-terminal de Vênus (Venus N ou VN) e o C-terminal de Vênus (Venus C ou VC). Estes fragmentos mantêm a capacidade de redobrar e tornar-se fluorescente quando na proximidade de 13. Cada fragmento de Vênus é fundido para o prodomínio da caspase, que é a porção mínima da caspase que vincula-se à plataforma de ativação. Isso garante que as caspases não reter a atividade enzimática e, portanto, a análise simultânea de jusante eventos associados a eventos endógenos é possível. A Vênus de fragmentos redobrar quando os prodomains de caspase são recrutados para a plataforma de ativação e passam por proximidade induzida. (Figura 1B). A fluorescência de Venus resultante pode ser usada com precisão e especificamente monitorar a Localização subcellular, a cinética e a eficiência do conjunto de plataformas de ativação de caspase iniciador em células únicas. Dados de imagem podem ser adquirido por microscopia confocal ou por microscopia de fluorescência padrão e pode ser adaptado para uma série de abordagens diferentes microscopia incluindo: imagem de lapso de tempo para controlar a ativação de caspase em tempo real; imagem de alta resolução para determinações precisas de Localização subcellular; e ponto final quantificação da eficiência de ativação.
Esta técnica foi desenvolvida para investigar a ativação de caspase-214. Enquanto a plataforma de ativação de caspase-2 é pensada para ser o PIDDosome, que consiste do receptor PIDD (proteína p53-induzido com um domínio de morte) e o adaptador RAIDD (RIP-associado ICH-1/CAD-3 proteínas homólogas com um domínio de morte), Ativação de caspase-2 independente de PIDDosome tem sido relatada. Isto sugere que plataformas adicionais de ativação de caspase-2 existem 15,16. Apesar de não saber os componentes completo da plataforma de ativação de caspase-2, permitiu-se a caspase BiFC técnica para interrogatório bem sucedido das vias sinalização caspase-2 para o nível molecular 14,17. Adaptámos também com êxito este protocolo para as caspases inflamatórias (caspase-1, -4, -5 e -12) 18 e, em princípio, a mesma abordagem deve ser suficiente para da mesma forma, analisar cada uma das caspases restantes do iniciador. Este protocolo da mesma forma pode ser adaptado investigar outros caminhos foram dimerização é um grande sinal de ativação. Por exemplo, as proteínas STAT são ativadas por dimerização após fosforilação por Janus quinase (JAK) 19. Assim, o sistema de BiFC pode ser usado para visualizar para ativação STAT, bem como muitas outras vias reguladas por interações proteína dinâmico. O seguinte protocolo fornece instruções passo a passo para a introdução dos repórteres em células, bem como as metodologias de análise e aquisição de imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo discute o uso de proteínas fluorescentes divisão para medir caspase induzida por proximidade. Split Vênus foi escolhida para esta técnica, porque é muito brilhante, altamente fotoestável e a dobrar é rápido 13. Assim, a análise de Vênus dobrar sobre proximidade de caspase induzida pode fornecer perto estimativas em tempo real da dinâmica de interação de proteínas caspase. Vênus é dividida em dois fragmentos ligeiramente sobrepostos, o N-terminal de Vênus (Venus-N ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós gostaríamos de reconhecer todos os membros anteriores do laboratório Bouchier-Hayes que contribuíram para o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de piloto pediátrica Hospital infantil do Texas a LBH. Agradecemos Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permissão para incluir dados publicados em colaboração com a equipe dela. O desenvolvimento dos reagentes descrito foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e a assistência de Joel M. Sederstrom
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
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