Освещение пути к Caspase активации с помощью Bimolecular флуоресценции дополнения
Summary
Этот протокол описывает caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ); метод на основе изображений, который может использоваться для визуализации индуцированных близость инициатора caspases, который является первым шагом в их активации.
Abstract
Каспаза семья протеаз играть существенную роль в апоптозе и врожденного иммунитета. Среди них подгруппы, известный как инициатор caspases являются первым, чтобы быть активированы в этих путей. Эта группа включает caspase-2, -8, -9, а также воспалительные caspases, caspase-1, -4 и -5. Инициатор caspases активируются путем димеризации после набора конкретных multiprotein комплексов, называется активации платформ. Caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) является подход на основе изображений где разделить флуоресцентных белков, сливается с инициатора caspases используются для визуализации вербовки caspases инициатора для их активации платформ и в результате Индуцированная близости. Этот флуоресценции обеспечивает индикацию одного из первых шагов, необходимых для инициатора активацию caspase. С помощью ряда различных подходов, основанных на микроскопии, этот метод может обеспечить количественные данные по эффективности caspase активации на уровне населения, а также кинетика активацию caspase и размер и количество активацию caspase комплексы на основе за клеток.
Introduction
Семья протеазы caspase известны за их решающую роль в апоптозе и врожденный иммунитет 1. Из-за их важности, определения того, когда, где и как эффективно конкретных caspases активируются может обеспечить решающую понимание механизмов caspase пути активации. Изображений на основе протокола, описанные здесь позволяет визуализации первых шагов в каскад активацию caspase. Этот метод использует динамический: протеин взаимодействия, активацию caspase диск.
Caspases можно разделить на две группы: инициатор caspases (caspase-1, -2, -4, -5, 8, -9, -10 и -12) и палач caspases (каспазы-3, -6 и -7). Палач caspases присутствуют в ячейке как предварительно димеры и активируются расщепление между больших и малых субъединица 2. При активации, они прилепится многочисленных структурных и регламентационных белки, что приводит к апоптозу 3. Инициатор caspases являются первым caspases активироваться в пути и как правило сработает активировать caspases палача. В отличие от caspases палача инициатор caspases активируются димеризации 4,5. Этот димеризации способствует набору неактивных мономеров для конкретных большой молекулярный вес комплексы, известный как активации платформ. Ассамблея активации платформ регулируется ряд конкретных: протеин взаимодействия. Эти опосредовано сохраненных белков взаимодействия мотивы в proform caspase инициатор и включают смерть домен (DD), смерть эффекторных домен (DED) и caspase набора доменов (карта) 6 (рис. 1A). Активации платформ, как правило, включают белка рецептора и адаптер белка. Обычно, рецептор активируется при Связывание лиганда, вызывая конформационные изменения, что позволяет для олигомеризации многочисленных молекул. Рецептор затем либо новобранцев caspase непосредственно или адаптер молекулы, которые в свою очередь принести caspase комплекса. Таким образом многочисленные caspase молекулы вступают в непосредственной близости, разрешительные димеризации. Это известно как модель индуцированных близости 7. После димерной, caspase подвергается autoprocessing, который служит для стабилизации активной фермента 4,8. Например Ассамблея Апоптосома Apaf1 инициируется c тситохрома после его освобождения из митохондрий в процессе, называемом митохондриальной внешней мембраны permeabilization (MOMP). Apaf1 в свою очередь новобранцев caspase-9 путем взаимодействия, при посредничестве карты присутствует в обоих белков 9. Аналогичный результат взаимодействия протеина в Ассамблее CD95 смерти заставить сигнальный комплекс (диск), приводит к активации caspase-8; PIDDosome, который можно активировать caspase-2; и различные Инфламмасома комплексы, которые инициировать активацию caspase-1 10,,1112. Таким образом инициатор caspases набираются для конкретных активации платформ общий механизм результате индуцированного близости и димеризации, без которого не произойдет активации.
Caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) является на основе изображений assay который был разработан для измерения этот первый шаг в активировать caspases инициатора, позволяя прямой визуализации caspase индуцированной близости после активации платформы Ассамблеи. Этот метод использует свойства Сплит флуоресцентный белок Венеры. Венера является ярче и более фотостабилен версии желтого флуоресцирующего белка (рекламы ЯФП), которые могут быть разделены на два номера люминесцентные и слегка перекрывающихся фрагментов: N-го Венеры (Venus N или VN) и C-конечная Венеры (Venus C или VC). Эти фрагменты сохраняют способность сворачивают и стать флуоресцентные в непосредственной близости от 13. Каждый фрагмент Венера сливается с prodomain каспазы, который является минимальным часть caspase, который привязывает к платформе активации. Это гарантирует, что caspases не сохраняют ферментативную активность и поэтому параллельный анализ течению событий, связанных с эндогенного события можно. Венера фрагменты, сворачивают при caspase prodomains набираются для активации платформы и проходят индуцированных близости. (Рис. 1B). Результате флуоресценции Венеры может использоваться конкретно и точно контролировать субцеллюлярные локализации, кинетика и эффективности Ассамблеи инициатором caspase активации платформ в одиночных клетках. Визуализации данных могут быть приобретены confocal микроскопии или стандартные флуоресцентной микроскопии и может быть адаптирована к ряду различных микроскопии подходов, в том числе: промежуток времени визуализации для отслеживания активацию caspase в режиме реального времени; высокое разрешение изображения для точного определения субцеллюлярные локализации; и конечную точку количественная оценка эффективности активации.
Этот метод был впервые разработан для расследования активацию caspase-214. В то время как платформы активацию caspase-2 считается PIDDosome, состоящий из рецептора Паспортный (белок p53-индуцированной с доменом смерти) и RAIDD (RIP-связанные ICH-1/CAD-3 гомологичных белок с доменом смерти), адаптер PIDDosome независимый активацию caspase-2 было сообщено. Это свидетельствует о том, что дополнительные активации платформ для caspase-2 существуют 15,16. Несмотря не зная полного компоненты платформы активацию caspase-2, caspase БМФЦ техника позволила успешно допроса caspase-2 сигнальных путей на молекулярном уровне 14,17. Мы также успешно адаптировать этот протокол для воспалительных caspases (caspase-1, -4 и -5 -12) 18 и в принципе, такой же подход должен быть достаточно аналогичным образом проанализировать каждый из оставшихся caspases инициатора. Этот протокол также может быть адаптирована для изучения других путей были димеризации основных активируя сигнал. К примеру стат белки активируются димеризации после фосфорилирования Janus киназа (Як) 19. Таким образом система БМФЦ может использоваться для визуализации для стат активации, а также многих других путей, регулируется динамических белковых взаимодействий. Следующий протокол предоставляет пошаговые инструкции для введения репортеров в клетки, а также методологий для захвата изображений и анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает использование Сплит флуоресцентных белков для измерения caspase индуцированной близости. Сплит Венера был выбран для этой техники, потому что это очень яркий, очень фотостабилен и складывая является быстрый 13. Таким образом анализ Венеры, складывая по…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить всех предыдущих членов лаборатории Бушье-Хэйес, которые способствовали развитию этой техники. Эта работа частично финансируется Техас Детская больница педиатрической пилот награду LBH. Мы благодарим Joya Чандра (MD Андерсон, Хьюстон, Техас) за разрешение включить данные, опубликованные в сотрудничестве со своей командой. Разработка реагентов описал была поддержана цитометрии и сортировка сердечник клетки в колледж Бейлор с финансирования из низ (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 и NCRR S10RR024574) и помощи Джоэл м. Sederstrom
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
