Analyse des minéraux produits par hFOB 1.19 et Saos-2 cellules à l’aide de microscopie électronique à Transmission avec Energy Dispersive x-ray Microanalysis

Summary

Nous présentons un protocole pour comparer l’état de minéraux dans les vésicules, sortis deux lignées de cellules d’os humains : hFOB 1.19 et Saos-2. Leurs profils de minéralisation ont été analysés par l’alizarine rouge-S (AR-S), de coloration, ultraviolette visualisation de lumière (UV), imagerie de microscopie électronique (met) de transmission et microanalyse à rayons x dispersive en énergie (EDX).

Abstract

Cette vidéo présente l’utilisation de la microscopie électronique à transmission avec microanalyse à rayons x dispersive en énergie (TEM-EDX) de comparer l’état de minéraux dans les vésicules, sortis deux lignées de cellules d’os humains : hFOB 1.19 et Saos-2. Ces lignées cellulaires, après le traitement avec l’acide ascorbique (AA) et β-glycérophosphate (β-GP), subir une complète transdifférenciation ostéogénique de prolifération à la minéralisation et produire des vésicules de matrice (MVs) qui déclenchent la nucléation d’apatite dans le matrice extracellulaire (MEC).

Après coloration alizarine rouge-S (AR-S) et analyse de la composition des minéraux dans les lysats cellulaires à l’aide de la lumière ultraviolette (UV) ou dans les vésicules en utilisant l’imagerie TEM suivie de quantification EDX et cartographie de l’ion, nous pouvons en déduire qu’ostéosarcome HRA-2 et ostéoblastique hFOB 1.19 cellules révèlent des profils distincts de la minéralisation. HRA-2 cellules minéralisent plus efficacement que les cellules hFOB 1.19 et produisent les plus grands gisements de minéraux qui ne sont pas visibles sous une lumière UV mais sont semblables au hydroxyapatite (HA) qu’ils ont des substitutions plus Ca et F.

Les résultats obtenus à l’aide de ces techniques nous permettent de conclure que le processus de minéralisation diffère selon le type de cellule. Nous proposons que, au niveau cellulaire, l’origine et les propriétés des vésicules de prédéterminent le type de minéraux.

Introduction

L’OS est un type de tissu conjonctif composé de deux parties : organique (les cellules et les fibres de collagène) et minéraux (composés de calcium et de phosphate). Les principaux éléments minéraux dans les os sont apatites¹. Différents types de cellules capables de minéralisation osseuse (ostéoblastes), dans les dents (odontoblastes) et dans le cartilage (chondrocytes) réglementent les étapes initiales de la minéralisation en produisant des protéines de la matrice extracellulaire (ECM) et en relâchant la matrice vésicules (MVs) (Figure 1). MVs sont 100-300 nm de diamètre vésicules qui s’accumulent de calcium et phosphate facilitant la nucléation d’apatite et par la suite se lient au collagène^2,3. Puis, MVs se désagrègent pour relâcher les apatites dans le milieu extracellulaire. Les apatites continuent de croître en contact avec les fibres de collagène et de former la matrice osseuse. La minéralisation est soutenue par l’apport constant de P_j’ai et Ca^{2 +} dans le milieu extracellulaire. Certaines données publiées récemment soutiennent notre modèle^4,5. Tissus mous minéraliser pas dans des conditions physiologiques. Cependant, les calcifications ectopiques peuvent survenir dans des conditions pathologiques telles que la calcification vasculaire³. Les cellules vasculaires qui acquièrent le phénotype ostéoblastique peuvent produire MVs qui induisent la nucléation des apatites et initient la minéralisation dans les couches médianes et intima de la paroi des vaisseaux sanguins. Depuis les calcifications ectopiques ressemblent à des normales endochondrale minéralisation³, comprendre les mécanismes moléculaires de la minéralisation des cellules osseuses et chondrocytes devrait fournir quelques indices sur la calcification des tissus mous qui sont ectopique formé.

Le développement des tissus osseux est régi par diverses enzymes, des facteurs de croissance et des promoteurs ou des inhibiteurs de minéralisation. L’action antagoniste du tissu non-spécifique à la phosphatase alcaline (SERVT) (Figure 1) et ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiestérase j’ai (NPP1), ainsi que de l’ankyrin (ANK), contrôle concentration pyrophosphate inorganique (PP_j’ai) ⁶. PP_j’ai, un puissant inhibiteur de la formation de HA, est hydrolysé par SERVT ; NPP1 hydrolyse triphosphates de nucléotides pour former PP_j’ai tandis que ANK PP j’exporte de la cellule à l’ECM. Le ratio de Pi/PPi peut réglementer apatite formation^7,8 , avec des conséquences pathologiques possibles⁹.

La membrane de MV est enrichie en protéines de transport des ions qui facilitent la précipitation initiale du calcium et du phosphate à l’intérieur de la VM au cours du processus de nucléation (Figure 1). Le transporteur de phosphate 1 (PiT) permet d’intégrer P_j’ai généré dans l’espace perivesicular dans le MVs^10,11. ANNEXINES peuvent être impliqués dans la liaison et transport de Ca^{2 +} et dans le processus biophysique qui initie la minéralisation dans le MV lumen^12,13. Nous sommes favorables à l’hypothèse, suggéré plus tôt, pour la minéralisation dans les vésicules intracytoplasmiques de nucléation interne d’apatite dans le MV avant sa propagation dans l’ECM^14,15. In vitro de modélisation a confirmé l’induction de Ca^{2 +}/ p_je complexes formation en protéoliposomes fait du PS et AnxA5¹⁶. Cela peut indiquer que l’accumulation de Ca^{2 +}, P_i, AnxA5 et PS complexes en radeaux lipidiques des microvillosités-comme membranesrepresent le noyau de la nucléation (NC) d’apatite dans Mvs ANNEXINES et SERVT possèdent également liant le collagène capacités qui peuvent être utiles en plaçant MVs le long des fibres de collagène et en stimulant la propagation de la minéralisation de la MEC. Fetuin A et ostéopontine (OPN)¹⁷, sont connus comme inhibiteurs de la formation d’apatite qui peuvent ralentir la propagation de la minéralisation à l’échafaud collagénique. Nucléation et propagation sont des événements distincts, le premier qui précède ce dernier, et les deux peuvent être pertinents pour le processus de minéralisation pathologique.

Pour découvrir comment la chimie des complexes de phosphate de calcium peut changer minéralisation physiologique et calcification ectopique, il est nécessaire d’identifier les minéraux produits de cellules. Apatites sont un groupe de calcium et de phosphate contenant des minéraux avec le cristal générales unité cellulaire formule Ca₁₀(PO₄)₆X₂, où X = Cl, F, OH. Ils sont classés comme suit¹⁸: fluorapatite (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ et hydroxyapatite (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

Le choix des lignées de cellules ostéoblastes à induire la formation de minéraux est crucial, puisque chaque lignée cellulaire montre un profil distinct de minéralisation. Dans ce rapport, nous avons comparé la nucléation des minéraux par deux modèles de cellule humaine de minéralisation : cellules ostéoblastique hFOB 1.19 et ostéosarcome HRA-2. Cellules dérivées d’ostéosarcome sont couramment utilisés comme modèles ostéoblastique et la Saos-2 cellules ont conservé le plus mature de caractère ostéoblastique¹⁹ tandis que les cellules indifférenciées hFOB foetale humaine sont largement utilisés comme modèle pour la normale ostéoblastique ²⁰de différenciation. Leurs profils de minéralisation ont été analysés par différentes méthodes : alizarine rouge-S (AR-S) coloration, ultraviolette visualisation de lumière (UV), imagerie de microscopie électronique (met) de transmission, énergie dispersive x-ray microanalysis (EDX) quantification et ion cartographie. L’avantage de TEM-EDX sur les autres techniques utilisées dans les études précédentes est qu’il donne des résultats quantitatifs et qualitatifs de remplacement ion en apatite cristaux^4,5,21. L’objectif global de l’utilisation de TEM-EDX était de trouver une méthode simple pour l’imagerie et la quantification de la répartition des ions Ca, F et Cl dans divers minéraux de différents types de cellules au cours des étapes distinctes du processus de minéralisation. Cette méthode a été utilisée avec succès, par exemple, pour surveiller l’interaction des nanoparticules de zinc avec des produits chimiques coexistantes et leurs effets combinés sur les organismes aquatiques,²². Dans une autre étude, un PHOTOCATALYSEUR cuivre sur matériaux titane en solution aqueuse a été largement caractérisée par spectrométrie d’émission optique de plasma à couplage inductif (ICP-OES), N2 physisorption (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman spectroscopie, TEM-EDX et photoélectrochimiques mesures²³. Notre but était de comparer l’origine et les propriétés de vésicules et de minéraux dans les deux lignées cellulaires pour comprendre le mécanisme qui contrôle la minéralisation durant la différenciation osseuse.

Figure 1 . Schéma des étapes initiales de la minéralisation dans les cellules osseuses impliquant la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire (ECM) et la libération des vésicules (MVs) de la matrice de la membrane. MVs accumulent calcium grâce à l’action des protéines liant le calcium, d’ANNEXINES et de phosphate, par l’action d’un transporteur de phosphate inorganique (PiT) suivi de l’activité du tissu non spécifiques à la phosphatase alcaline (SERVT), qui dephosphorylates PP_j’ai P_je, facilitant ainsi la nucléation d’apatite. Ensuite, MVs se désintègrent et libérer des apatites dans le milieu extracellulaire. La minéralisation est soutenue par l’apport constant de P_j’ai et Ca^{2 +} dans le milieu extracellulaire^4,5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Culture et traitement des cellules Mettre tout le matériel nécessaire sous la hotte à flux laminaire et stériliser leur sous la lumière UV. Les milieux de culture sont : un mélange 1:1 de jambon de médias F12 et DMEM avec 2,5 mM de L-glutamine additionné de 100 U/mL de pénicilline, 100 U/mL de streptomycine, 0,3 mg/mL G418 et 10 % sérum fœtal (SVF) (v/v) d’antigène de foetus humain hFOB 1.19 SV40 grand T transfectées les ostéoblastes et milieu de McCoy 5 a 1,5 mM de L-glutamine additionné d…

Representative Results

TEM-EDX permettant l’imagerie in vitro des vésicules de matrice (MVs) publiés par minéralisation des cellules et des minéraux produit de Mvs les résultats obtenus à l’aide de cette technique démontrent que le processus de minéralisation peut procéder différemment dans divers types de cellules. Les deux lignées ont reçu le même traitement de transdifférenciation ostéoblastique, mais stimulés HRA-2 cellules minéralisé plus efficacement que hFOB 1,19 o…

Discussion

Dans le présent document, nous avons décrit les protocoles pour AR-S, coloration, identification de lumière UV de fluorapatite et TEM-EDX in vitro imagerie de MVs publiés par minéralisation des cellules et des minéraux produits par MVs. Il est possible d’aborder toutes les méthodes mentionnées ci-dessus en suivant quelques étapes de dépannage courantes. Afin d’obtenir des résultats optimaux, plusieurs étapes critiques doivent être effectuées avec soin. Tout d’abord, il est préférab…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings