선물이 두 인간의 뼈 세포 선으로 발표 하는 소포에 미네랄의 상태를 비교 하는 프로토콜: hFOB 1.19와 Saos-2. 그들의 강화 프로 파일에 의해 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 및 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX)을 분석 했다.
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방법 논문
미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석
이 논문에서
요약
초록
이 비디오 전송 전자 현미경 검사 법의 사용 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis을 소포 두 인간의 뼈 세포 라인에 의해 발표에서 미네랄의 상태를 비교할 (가장 EDX) 선물: hFOB 1.19와 Saos-2. Ascorbic 산 (AA)와 β-glycerophosphate (β-GP), 치료 후 이러한 셀 라인 강화를 확산에서 완전 한 osteogenic transdifferentiation를 받아야 매트릭스 소포 (MVs)에서 인회석 nucleation 트리거하는 생산 하 고는 세포 외 매트릭스 (ECM)입니다.
알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩 및 미네랄 자외선 (UV)를 사용 하 여 세포 lysates 또는 소포 편 이미징 EDX 정량 및 이온 매핑을 사용 하 여 구성의 분석을 바탕으로, 우리가 그 다리를 유추할 수 Saos-2 그리고 osteoblastic hFOB 1.19 셀 별개 강화 프로필 공개. Saos-2 셀 hFOB 1.19 셀 보다 더 효율적으로 형성할 고 생산 자외선 아래 표시 되지 않습니다 하지만 비슷합니다 hydroxyapatite (HA) 들은 더 많은 Ca와 F 대체에 큰 무기물 예금.
이러한 기술을 사용 하 여 얻은 결과 수 결론 강화 작용 과정 세포 유형에 따라 다릅니다. 우리는, 세포 수준에서 기원과 vesicles의 속성 미리 미네랄의 종류를 제안 합니다.
서론
뼈는 두 부분으로 구성 된 결합 조직: 유기 (세포와 콜라겐 섬유)과 미네랄 (칼슘, 인산 화합물). 뼈에 주요 미네랄 구성 요소는 apatites1. 다른 종류의 강화 유능한 세포 뼈 (osteoblasts), 치아 (odontoblasts)와 연골 (chondrocytes) 규제 강화의 초기 단계는 세포 외 기질 (ECM)의 단백질을 생산 하 고 매트릭스를 발표 하 여 소포 (MVs) (그림 1). MVs는 100-300 nm 직경 소포 칼슘과 인회석 nucleation 촉진 인산 축적 하 고 그 후 콜라겐2,3를 바인딩할. 다음, MVs extracellular 매체에 apatites를 풀어 분해. apatites 계속 콜라겐 섬유 접촉 성장과 뼈 매트릭스를 형성 합니다. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + 세포 외 매체에서의 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 최근 게시 된 데이터 지원 우리의 모델4,5. 부드러운 조직 생리 적인 조건 하에서....
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프로토콜
1. 세포 배양 및 치료
- 층 류 두건 아래 모든 필요한 자료를 넣고 아래 자외선 소독. 문화 미디어는: 1:1 혼합물 햄의 F12 및 DMEM 미디어 2.5 m L-글루타민 보충 100 U/mL 페니실린와 100 U/mL 스, 0.3 mg/mL G418 10% 소 태아 혈 청 (FBS) (v/v) 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 큰 T 항 원 페에 대 한 osteoblasts, 그리고 맥 코이 5A 매체 1.5 m L-글루타민 보충과 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 15 %FBS (v/v) 인간의 다리 Saos-2 셀.
- 5% CO2 의 분위기에서 34 ° C에서 hFOB 1.19 셀과 5%의 분위기 속에서 37 ° C에서 Saos-2 셀 문화 공동2. 층 류 두건에 인큐베이터에서 세포 배양, 어느 hFOB 1.19 또는 Saos-2 셀을 전송 하 고 매체 FBS와 신선한 문화 매체의 10 mL에 변경 합니다.
- 자극 (휴식 셀) 없이 셀을 품 어 또는 50 µ g/mL Ascorbic 산 (AA) 7.5 m m β-Glycerophosphate (β-GP), 초순 앞부분에서 준비와 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링 된 다음 그들을 자극 합니다. 문화 매체의 표면에 플라스틱 ....
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결과
가장 EDX 체 외에 이미징 매트릭스 소포 (MVs) 셀 mineralizing 발표와 M대 강화 작용의 과정을 다르게 진행할 수 있습니다이 기술을 사용 하 여 얻은 결과 입증 하 여 생산 하는 미네랄의 수 에 셀의 다양 한 종류. 두 셀 라인 같은 osteoblastic transdifferentiation 치료를 받은 아직 자극된 Saos-2 셀 mineralized hFOB 보다 더 효율적으로 1.19 osteoblasts 아칸소-S에 의해 입증으로 얼룩 (그림 2). 이 hFOB 1.19 셀20에 비해 Saos-2 셀19 의 더 성숙한 osteoblast 형 때문일 수도 있습니다. 만든 UV transilluminator를 사용 하 여 샘플의 시각화 그것 취소만 fluorapatites UV 빛.......
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토론
현재 신문에서 우리에 대 한 아칸소-얼룩, fluorapatite의 UV 빛 식별 프로토콜을 설명 하 고 가장 EDX 체 외에 이미징 MVs 셀 mineralizing 발표와 미네랄의 MVs. 에 의해 생산 그것은 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계에 따라 위에서 언급 한 모든 메서드를 해결 수 있습니다. 최적의 결과 얻으려면 몇 가지 중요 한 단계는 신중 하 게 수행 되어야 한다. 첫째, 그것은 AA (산 성) 인 β-GP (알칼리 성) 인 문화 매체의 pH 7.4를 유지 하기 위해 다음 추가 좋습니다. 둘째, 아칸소-S 얼룩, 후 얼룩진된 칼슘 예금은 매우 깨지기 쉬운 고 셀 PBS 추가 시 결정의 파괴를 방지 하기 위해 매우 세 심하게 세척 되어야 한다. 셋째, 항상 리드 컨테이너에서 uranyl 아세테이트를 유지 하 고 희석된 일부만 고정 사용 해야 하기 때문에 앙금을 선택 하지 마십시오. 넷째, AA와 uranyl 아세테이트는 빛에 민감한 및 어두운 방에 처리 한다 기억 하십시오. 다섯째,.......
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공개 사항
저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.
감사의 글
MK 및 요청 수동 작업을 수행 하는 파운드 그림을 준비 하 고 만든 영화. ASK 쓴 원고, 파운드 쓴 스크립트와 MK 준비 테이블. SM, RB 및 SP는 비판적으로 테이블, 스크립트 및 원고 읽기. 저자 ultramicrotomy와 그녀의 훌륭한 지원에 대 한 한 나 Chomontowska로 Szymon Suski와 헨리크 Bilski 가장 EDX 분석 그들의 훌륭한 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자는 전문 영어 교정 패트릭 나무와 지시를 기록 하기 위한 바바라 Sobiak 박사 감사 하 고 싶습니다.
이 일 파운드 및 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 프로젝트 BIOIMAGINE에 국립 과학 센터, 폴란드 2016/23/N/NZ4/03313에서 교부 금에 의해 물어, 과학 및 고 등 교육의 폴란드어 사역에서 N N401 140639 그랜트에 의해 지원 되었다 : 바이오 이미징 연구 혁신 및 교육, 조지아 No. 264173, 그리고 법정 자금의 Nencki 연구소의 실험 생물학, 아카데미 과학의 폴란드어.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>시약 | |||
| 햄' s DMEM/F12 배지 혼합물 | PAA | E15-813 | 1:1, 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 대형 T 항원 형질주입 조골세포(ATCC CRL-11372) |
| McCoy' s 5A 매체 | PAA | E82312-0025 | 인간 골육종 Saos-2 세포(ATCC, HTB-85), |
| 항생제 혼합물(페니실린/스트렙토마이신), | 시그마 | P0781-100ML | 각 100 U/mL |
| G-418 | 시그마 | 68168 | 0.3 mg/mL |
| FBS | Gibco | 10270 | hFOB 1.19의 경우 10% 및 Saos-2 |
| AA | 시그마 | A-5960 50 | &마이크로의 경우 15%; g/mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7.5 mM |
| Bio-Gel | HTP Gel Bio-Rad | 130-0420 | for HA |
| FA | us | ||
| CA | |||
| CA Sodium phosphate 완충제 Na2HPO4/NaH2PO4 혼합물 | Sigma | S7907/S8282 | 0.1 M, pH 7.2 |
| PBS | pH 7.0, | ||
| PBS Sigma | A5533-25G | 0.5 g/100 mL, pH 5.0 | |
| 콜라겐 분해효소 유형 IA | Sigma | C2674 | 500 U/mL |
| SCL 완충액 | 제조 | ||
| 한 | 탈이온화 웨이퍼 | ||
| 탄올 | POCh | BA6480111 | 절대 99.8 % 및 용액 25, 50, 75, 90 |
| % 우라닐 아세테이트 50 % 에탄올 | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0.25 g/10 mL |
| PD 매체 | pH 7.4, 당사 준비 | ||
| 고정 혼합물(파라포름알데히드/글루타르알데히드) | Sigma | 158127/G-6257 | 3%:1% |
| Post-fixation OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
| LR 에탄올 | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2, 1:1, 100% |
| 아세톤 | CHEMPUR | 111024800 | 순수 |
| <강력한>도구 | |||
| 극저온 바이알 | Corning Inc. | 430487 | 1.2 mL |
| 플라스틱 페트리 배양 접시 | Falcon | 353003 | 100 mm |
| 플라스틱 튜브 | , Falcon | 352096 및 352070 | 15 및 50 mL |
| 혈청학 피펫, | Falcon 및 VWR | 357521 및 612-3700 | 1 및 10 mL |
| 플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브 | , Sigma | Z688312 및 Z628034 | 1.5 mL 검정색 및 2 mL |
| 투명 플라스틱 팁 | VWR | 613-0364, 613-0239 및 613-1050 | 0.1-10 &마이크로; L 자연, 1-200 &마이크로; L 노란색 및 200-1000 µ L 파란색 |
| 플라스틱 랙 | Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | 튜브용 녹색, 마이크로 튜브용 주황색, TEM 프로브용 파란색 |
| Laminar Hera Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | HEPA 필터(DIN EN 1822에 따른 H14) |
| 인큐베이터 Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34°C; hFOB 1.19 및 37°의 경우 C; C, Saos-2 |
| 흄 후드 | POLON | WCS-2 | , TEM 염색, |
| 유리병 | SIMAX | 1632414501050 및 1632414501100 | 50 및 100 mL |
| 석영 유리관 | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 |
| mm 펌프 | , IBS Integra Biosciences | VACUSAFE 진공 오븐 | 용 |
| Memmert | UNE 400 | 56&데그; C | |
| 도자기 멀티 웰 플레이트 | Rosenthal technik | 229/12 | 12 웰 |
| 유리 비커 | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
| 유리병 | Pocord | DIN22 | 10 mL |
| 플라스틱 상자 | Agar Scientific Ltd. | 어둠을 위해 | |
| 스냅 핏 젤라틴 캡슐 | Agar Scientific Ltd. | G3741 | 크기 1 |
| Formvar/Carbon 300 메쉬 Ni 그리드 상자 | Agar Scientific Ltd. | S162N3 | 필름, 광택 면, |
| 실리콘 셀 스크레이퍼 | Sigma | SIAL0010-100EA | 크기: 1.8/25cm |
| 주사기(바늘 포함 | BogMark | 007 | 사기, 1mL, 40U, 바늘: 0.5 x 16 |
| 사기 | : Chirana | CH005L | , 5mL |
| 원심분리기 | MPW, 의료기기 | , MPW-350R, | 130xg, 500xg, |
| 자외선 투과기 | UVP | 가시광선 및 자외선용 | |
| 초박절개 | LKB | NOVA | 700Å 섹션 |
| 블록 홀더 | LKB | E6711 | 원형 |
| 다이아몬드 나이프 | DiATOME | Ultra 45° | 사이즈 3 |
| 속눈썹 홀더 | 소, 미국 | ||
| 집게 | ROTH | 2855.1 | 그리드 용 정전기 방지 |
| 주걱 세트 | ROTH | E286.1 | 정전기 방지 파우더 |
| 용 < 강력>이미징 < / 강력 > | |||
| 반전 광 현미경 | Zeiss with Canon | AxioObserver Z1 PowerShot G9 | 위상차, 투과광, 20 x 대물렌즈, RGB 필터 |
| 투과전자현미경 | TEM, Oxford Instruments 및 SiS-Olympus | JEM-1400 TEM, 전 범위 INCA 에너지 분산형 X선 미세분석(EDX) 시스템 및 11메가픽셀 MORADA G2 카메라 | 배율, TEM용 50,000X 및 STEM 및 EDX용 15,000X |
| 카메라 본체 및 렌즈 | 니콘 | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D | 동영상 녹음용 |
| 마이크 | MXL 마이크 | 템포 |
참고문헌
- Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
- Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
- Anderson, H. C. Matrix v....
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재인쇄 및 허가
