Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse

Summary

We presenteren een protocol om te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming en energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX).

Abstract

Deze video presenteert het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse (TEM-EDX) te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Deze cellijnen, na behandeling met ascorbinezuur (AA) en β-glycerophosphate (β-GP), ondergaan van volledige osteogenic transdifferentiatie van proliferatie te mineralisatie en produceren van matrix blaasjes (MVs) die leiden tot apatiet nucleatie in de extracellulaire matrix (ECM).

Gebaseerd op Alizarine Red-S (S-AR) kleuring en analyse van de samenstelling van mineralen in cel lysates met behulp van ultraviolet (UV) licht of blaasjes met behulp van TEM imaging gevolgd door EDX kwantificatie en ion mapping, we kunnen afleiden dat Osteosarcoom Saos-2 en osteoblastic hFOB 1.19 cellen onthullen verschillende mineralisatie profielen. Saos-2 cellen efficiënter dan hFOB 1.19 cellen mineralize en produceren van grotere minerale afzettingen die zijn niet zichtbaar onder UV-licht, maar zijn vergelijkbaar met hydroxyapatiet (HA) in dat ze meer Ca en F vervangingen hebben.

De resultaten verkregen met behulp van deze technieken kunnen we concluderen dat het proces van mineralisatie afhankelijk van het celtype verschilt. Wij stellen voor dat, op het cellulaire niveau, de herkomst en eigenschappen van blaasjes vooraf het type van mineralen bepalen.

Introduction

Bot is een soort bindweefsel bestaat uit twee delen: organische (cellen en collageenvezels) en mineralen (calcium en fosfaat verbindingen). De belangrijkste minerale componenten in botten zijn apatites¹. Verschillende soorten mineralisatie-bevoegde cellen in bot (botcellen), tanden (odontoblasts) en kraakbeen (chondrocyten) regelen de eerste stappen van mineralisatie door de productie van eiwitten van de extracellulaire matrix (ECM) en het vrijgeven van matrix blaasjes (MVs) (Figuur 1). MVs zijn 100-300 nm diameter blaasjes die zich ophopen van calcium en fosfaat te vergemakkelijken apatiet nucleatie en vervolgens binden aan collageen^2,3. Vervolgens desintegreren MVs om apatites aan het extracellulaire medium vrij te geven. De apatites blijven groeien in het contact met de collageenvezels en vormen de bot-matrix. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van P_ik en Ca^{2 +} in het extracellulaire medium. Sommige onlangs gepubliceerde gegevens ondersteunen onze model^4,5. Zachte weefsels doen niet mineralize onder fysiologische omstandigheden. Ectopische verkalking kan zich echter voordoen onder pathologische omstandigheden zoals vasculaire verkalking³. Vasculaire cellen die het osteoblast fenotype verwerven kunnen produceren MVs dat induceren nucleatie van apatites en initiëren van mineralisatie in de mediale en intima lagen van de wand van de bloedvaten. Sinds ectopische verkalking lijken op normale endochondral mineralisatie³, inzicht in de moleculaire mechanismen van mineralisatie van ossaal cellen en chondrocyten dienen enkele aanwijzingen op ectopische verkalking van de zachte weefsels die gevormd.

De ontwikkeling van het skelet weefsels wordt geregeld door verschillende enzymen, groeifactoren, en initiatiefnemers of remmers van mineralisatie. De antagonistische actie van weefsel-nonspecific alkalisch fosfatase (TNAP) (Figuur 1) en ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiësterase ik (NPP1), samen met ankyrin (ANK), besturingselementen concentratie van de anorganische pyrofosfaat (PP_ik) ⁶. PP_ik, een krachtige remmer van HA formatie, is gehydrolyseerd door TNAP; NPP1 ontstabiel nucleotide trifosfaat tot PP_ik terwijl ANK uitvoer PP_ik uit de cel aan de ECM. De Pi/PPi verhouding kan reguleren apatiet vorming^7,8 met mogelijke gevolgen van de pathologische⁹.

De MV membraan is verrijkt met ion vervoer eiwitten die het eerste neerslaan van calcium en fosfaat binnen de MVs tijdens de nucleatie (Figuur 1 vergemakkelijken). De fosfaat transporter 1 (PiT) helpt te nemen P_ik gegenereerd in de perivesicular ruimte in de MVs^10,11. Annexins kan worden betrokken in het bindende en vervoeren van Ca^{2 +} en de biofysische proces waarmee mineralisatie in de MV lumen^12,13. Wij keuren de hypothese, eerder voorgesteld voor mineralisatie binnen intracytoplasmatische blaasjes van interne nucleatie van apatiet binnen de MV voordat de vermeerdering in de ECM^14,15. In vitro modellering bevestigd de inductie van Ca^{2 +}/P_ik complexen vorming in proteoliposomes gemaakt van PS en AnxA5¹⁶. Dit kan erop duiden dat accumulatie van Ca^{2 +}, P_i, AnxA5 en PS complexen in lipide vlotten van de microvilli-achtige membranesrepresent de nucleatie kern (NC) van apatiet binnen MVs. Annexins en TNAP bezitten ook collageen-bindende capaciteiten die nuttig zijn in het plaatsen van MVs langs collageenvezels en bij het stimuleren van de verspreiding van mineralisatie in de ECM kunnen zijn. Fetuin A en osteopontin (OPN)¹⁷, staan bekend als remmers van apatiet formatie die de verspreiding van mineralisatie op de collagene steiger kan vertragen. Nucleatie en vermeerdering zijn verschillende evenementen, de voormalige voorafgaand aan de laatste, en beide relevant kunnen zijn voor het proces van pathologische mineralisatie.

Om te ontdekken hoe de chemie van calciumfosfaat complexen fysiologische mineralisatie en ectopische verkalking kan veranderen, is het noodzakelijk om te identificeren van de mineralen geproduceerd door cellen. Apatites zijn een groep van calcium en fosfaat met mineralen met de algemene crystal eenheid cel Ca formule₁₀(PO₄)₆X₂, waarbij X = Cl, F, OH. Ze worden geclassificeerd als volgt¹⁸: fluorapatiet (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ en hydroxyapatiet (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

De keuze van osteoblast cellijnen voor het opwekken van minerale vorming is van cruciaal belang, aangezien elke cellijn een duidelijk profiel van mineralisatie vertoont. In dit verslag, vergeleken we de nucleatie van mineralen door twee geselecteerde menselijke cel modellen van mineralisatie: osteoblastic hFOB 1.19 cellen en Osteosarcoom Saos-2 cellen. Osteosarcoom-afgeleide cellen worden vaak gebruikt als osteoblastic modellen en Saos-2 cellen zijn de meest volwassen osteoblastic teken¹⁹ bewaard terwijl ongedifferentieerde menselijke foetale hFOB cellen veel als een model voor de normale osteoblastic gebruikt worden differentiatie²⁰. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door verschillende methoden: Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) imaging, energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX) kwantificatie en ion in kaart brengen. Het voordeel van de TEM-EDX over alternatieve technieken die worden gebruikt in eerdere studies is dat het kwantitatieve en kwalitatieve resultaten van ion vervanging in apatiet kristallen^4,5,21geeft. Het algemene doel van het gebruik van de TEM-EDX was te vinden van een eenvoudige methode voor beeldbewerking en kwantificering van de verdeling van de Ca, F en Cl-ionen in verschillende mineralen uit verschillende soorten cellen tijdens de verschillende fasen van het proces van mineralisatie. Deze methode is met succes gebruikt, bijvoorbeeld voor het toezicht op de interactie van zink nanodeeltjes met naast elkaar bestaande chemische stoffen en hun gecombineerde effecten op aquatische organismen²². In een andere studie, een koperen photocatalyst op titanium materialen in waterige oplossing werd uitgebreid gekenmerkt door middel van inductief gekoppeld plasma optische-emissiespectrometrie (ICP-OES), N2 physisorption (inzet), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spectroscopie, TEM-EDX en photoelectrochemical metingen²³. Ons doel was om te vergelijken van de herkomst en eigenschappen van blaasjes en mineralen in twee cellijnen te begrijpen van het mechanisme waarmee mineralisatie tijdens werden differentiatie.

Figuur 1 . Regeling van de eerste stappen van mineralisatie in werden cellen waarbij de synthese van de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten en vrijlating van matrix blaasjes (MVs) van de membraan. MVs accumuleren calcium door de werking van calcium bindende proteïnen, annexins en fosfaat, door de werking van een anorganisch fosfaat transporter (PiT) gevolgd door de activiteit van weefsel aspecifieke alkalisch fosfatase (TNAP), die dephosphorylates PP_ik om P_ik, teneinde apatiet nucleatie. Vervolgens MVs desintegreren en vrij van apatites aan het extracellulaire medium. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van P_ik en Ca^{2 +} in de extracellulaire middellange^4,5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

1. cultuur en behandeling van de cel Zet alle noodzakelijke materialen onder de motorkap laminaire flow en steriliseren hen onder UV-licht. De voedingsbodems zijn: een 1:1-mengsel van Ham de F12 en DMEM media met 2.5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine, 0,3 mg/mL G418 en 10% foetale runderserum (FBS) (v/v) voor menselijke foetus hFOB 1.19 SV40 grote T antigeen transfected Botcellen en McCoy’s 5A medium met 1,5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL stre…

Representative Results

TEM-EDX zorgt voor de beeldvorming in vitro van matrix blaasjes (MVs) uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. de resultaten verkregen met behulp van deze techniek laten zien dat het proces van mineralisatie anders kan gaan in verschillende soorten cellen. De twee cellijnen ontvangen dezelfde osteoblastic transdifferentiatie behandeling, maar gestimuleerd Saos-2 cellen gemineraliseerde efficiënter dan hFOB 1.19 botcellen, zoals blijkt uit…

Discussion

In het huidige document, beschreven we de protocollen voor AR-S kleuring, UV licht identificatie van fluorapatiet en TEM-EDX in vitro beeldvorming van MVs uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. Het is mogelijk om alle methodes hierboven vermeld door sommige gemeenschappelijke stappen voor probleemoplossing te volgen. Met het oog op een optimale resultaten, moeten verschillende kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Eerst, is het beter om toe te voegen AA (die i…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings