Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Ihre Mineralisierung Profile wurden von Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung, Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung und Energie dispersiven Röntgen-Mikroanalyse (EDX) analysiert.

Abstract

Dieses Video zeigt die Verwendung von Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy dispersive x-ray Mikroanalyse (TEM-EDX), den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Diese Zell-Linien, nach der Behandlung mit Ascorbinsäure (AA) und β-glycerophosphat (β-GP), komplette osteogene Transdifferenzierung von Verbreitung, Mineralisierung zu unterziehen und produzieren Matrix Vesikel (MVs), die Apatit Keimbildung bei Auslösen der extrazelluläre Matrix (ECM).

Basierend auf Alizarin rot-S (AR-S) Färbung und Analyse der Zusammensetzung von Mineralien in Zelle Lysates mit ultraviolettem (UV) Licht oder in Vesikeln TEM Bildgebung gefolgt von EDX-Quantifizierung und Ionen-Mapping verwenden, können wir daraus schließen, dass Osteosarkom Saos-2 und osteoblastischen hFOB 1.19 Zellen zeigen unterschiedliche Mineralisierung Profile. Saos-2 Zellen effizienter als hFOB 1.19 Zellen mineralisieren und produzieren größere mineralische Ablagerungen, die nicht unter UV-Licht sichtbar, aber ähneln Hydroxylapatit (HA), dass sie mehr Ca und F Vertretungen haben.

Die erzielten Ergebnisse mit diesen Techniken ermöglichen uns zu dem Schluss, dass der Prozess der Mineralisierung unterscheidet sich je nach Zelltyp. Wir schlagen vor, dass auf zellulärer Ebene, die Herkunft und die Eigenschaften von Vesikeln die Art der Mineralien bestimmen.

Introduction

Knochen ist eine Art von Bindegewebe besteht aus zwei Teilen: Bio (Zellen und Kollagenfasern) und Mineralien (Calcium und Phosphat-Verbindungen). Die mineralischen Hauptbestandteile in den Knochen sind Apatite¹. Verschiedene Arten von Mineralisierung-kompetente Zellen in Knochen (Osteoblasten), Zähne (Odontoblasts) und im Knorpel (Chondrozyten) regulieren die ersten Schritte der Mineralisierung durch Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) und loslassen matrix Vesikel (MVs) (Abbildung 1). MVs sind 100-300 nm Durchmesser Vesikel, die Calcium- und Phosphatspiegel, die Erleichterung der Apatit Keimbildung zu sammeln und anschließend binden an Kollagen^2,3. Dann zerfallen MVs Apatite auf das extrazelluläre Medium lösen. Die Apatite weiterhin in Kontakt mit Kollagenfasern wachsen und bilden der Knochenmatrix. Die Mineralisierung wird durch die konstante Versorgung mit P_ich und Ca^{2 +} im extrazellulären Medium getragen. Einige kürzlich veröffentlichten Daten unterstützen unsere Modell-^4,–⁵. Weichteile nicht unter physiologischen Bedingungen mineralisieren. Ektopische Verkalkung kann jedoch unter pathologischen Bedingungen wie Gefäßverkalkung³auftreten. Vaskuläre Zellen, die Osteoblasten Phänotyp erwerben können MVs produzieren, die Keimbildung von Apatite zu induzieren und Mineralisierung in den medialen und Intima Schichten der Wand der Blutgefäße zu initiieren. Seit ektopische Verkalkung ähneln normalen Endochondral Mineralisierung³, Verständnis der molekularen Mechanismen der Mineralisierung der Knochen Zellen und Chondrozyten sollen einige Hinweise auf ektopische Verkalkung der Weichteile, die gebildet.

Die Entwicklung des skelettartigen Gewebe wird durch verschiedene Enzyme, Wachstumsfaktoren und Promotoren oder Inhibitoren der Mineralisierung geregelt. Die Antagonistische Wirkung der Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP) (Abbildung 1) und Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase kontrolliert ich (NPP1), zusammen mit Ankyrin (ANK), anorganisches Pyrophosphat (PP_ich) Konzentration ⁶. PP_ich, ein potenter Inhibitor der HA-Formation ist hydrolysiert durch TNAP; NPP1 hydrolysiert Nukleotid Triphosphate um PP_ich zu bilden, während ANK PP_ich in das ECM aus der Zelle exportiert. Das Verhältnis von Pi/PPi kann Apatit Bildung^7,8 mit möglichen pathologischen folgen⁹regulieren.

Die MV-Membran ist in Ionen-Transport-Proteine angereichert, die die erste Ausfällung von Kalzium und Phosphat im Inneren der MVs bei der Keimbildung (Abbildung 1) zu erleichtern. Die Phosphat-Transporter 1 (PiT) hilft, um P_ich erzeugt im Perivesicular Raum in der MVs^10,11zu integrieren. Polymerasen können beteiligt sein, in die Bindung und den Transport von Ca^{2 +} und in den biophysikalischen Prozess, der Mineralisierung in der MV Lumen^12,13initiiert. Wir favorisieren die Hypothese vorgeschlagen, für die Mineralisierung innerhalb Intrazytoplasmatische Vesikel des internen Keimbildung von Apatit innerhalb der MV vor ihrer Ausbreitung in der ECM-^14,–¹⁵. In-vitro- Modellierung bestätigt die Induktion von Ca^{2 +}/ p_ich komplexe Bildung in Proteoliposomes aus PS und AnxA5¹⁶hergestellt. Dies kann darauf hindeuten, dass Akkumulation von Ca^{2 +}, P_ich, AnxA5 und PS-komplexe in Lipid Rafts der Mikrovilli-wie Membranesrepresent der Keimbildung Kern (NC) Apatit innerhalb MVs. Polymerasen und TNAP besitzen auch Kollagen-Bindung Kapazitäten, die möglicherweise hilfreich bei der Platzierung von MVs entlang Kollagenfasern und bei der Förderung der Ausbreitung von Mineralisierung in der ECM. Fetuin-A und Osteopontin (OPN)¹⁷, sind bekannt als Inhibitoren der Apatit-Formation, die die Ausbreitung der Mineralisierung auf dem kollagenen Gerüst verlangsamen kann. Keimbildung und Vermehrung sind unterschiedliche Veranstaltungen, erstere vor dem letzteren, und sowohl für den Prozess der pathologischen Mineralisierung relevant sein können.

Um herauszufinden, wie die Chemie des Calcium-Phosphat-komplexen physiologischen Mineralisierung und ektopische Verkalkung ändern kann, ist es notwendig, die Mineralien produziert von Zellen zu identifizieren. Apatite sind eine Gruppe von Kalzium und Phosphat enthalten Mineralien mit dem allgemeinen Kristall Zelle Formel Ca₁₀(PO₄)₆X₂, wobei X = Cl, F, OH. Sie gelten als¹⁸folgt: Fluorapatit (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ und Hydroxylapatit (HA) Ca₁₀(PO₄ ),₆(OH)₂.

Die Wahl der Osteoblasten Zelllinien induzieren MINERALBILDUNG ist entscheidend, denn jede Zelllinie ein klares Profil der Mineralisierung zeigt. In diesem Bericht verglichen wir die Keimbildung der Mineralien von zwei ausgewählten menschlichen zellmodelle Mineralisierung: osteoblastischen hFOB 1.19 und Osteosarkom Saos-2 Zellen. Osteosarkom-abgeleitete Zellen werden häufig als osteoblastischen Modelle verwendet und Saos-2 Zellen haben die reifsten osteoblastischen Charakter¹⁹ beibehalten, während undifferenzierte menschlichen fetalen hFOB Zellen häufig als Modell für normale osteoblastischen verwendet werden Differenzierung-²⁰. Ihre Mineralisierung Profile wurden mit verschiedenen Methoden analysiert: Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung, Energy dispersive x-ray Mikroanalyse (EDX) Quantifizierung und Ion Mapping. Der Vorteil von TEM-EDX über alternative Techniken verwendet in früheren Studien ist, dass es quantitative und qualitative Ergebnisse der Ionen-Austausch in Apatit Kristalle^{4,5,21 gibt}. Das übergeordnete Ziel der Verwendung von TEM-EDX war, eine einfache Methode für Bildgebung und Quantifizierung der Verteilung von Ca, F und Cl-Ionen in verschiedenen Mineralien aus verschiedenen Arten von Zellen während der Phasen des Prozesses Mineralisierung zu finden. Diese Methode erfolgreich, zum Beispiel dient zur Überwachung der Wechselwirkung von Zink-Nanopartikel mit verschiedenen Chemikalien und ihre kombinierte Wirkung auf Wasserorganismen²². In einer weiteren Studie, ein Kupfer Photocatalyst auf Titan-Materialien in wässriger Lösung ausführlich zeichnete sich durch optische emissionsspektrometrie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-OES), N2 Physisorption (BET), XRD, UV-Vis-DRS, FT-IR, Raman Spektroskopie, TEM-EDX und photoelektrochemische Messungen²³. Unser Ziel war es, die Herkunft und Eigenschaften der Vesikel und Mineralien in beiden Zelllinien, den Mechanismus zu verstehen, der Mineralisierung im knöchernen Differenzierung steuert zu vergleichen.

Abbildung 1 . Schema der ersten Schritte der Mineralisierung im knöchernen Zellen mit der Synthese von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) und Freisetzung von Matrix Vesikel (MVs) aus der Membran. MVs akkumulieren Kalzium durch die Einwirkung von Kalzium-bindende Proteine, Polymerasen und Phosphat, durch das Wirken des ein anorganisches Phosphat-Transporter (PiT) gefolgt von der Aktivität der Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP), dem dephosphorylates PP_ich P_ich, wodurch Apatit Keimbildung. Dann MVs zerfallen und freigeben Apatite auf das extrazelluläre Medium. Die Mineralisierung wird durch die konstante Versorgung mit P_ich und Ca^{2 +} in der extrazellulären mittlere^4,5getragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

(1) Zell-Kultur und Behandlung Setzen Sie alle notwendigen Materialien unter der Laminar-Flow-Haube und unter UV-Licht zu sterilisieren. Die Nährmedien sind: eine 1:1 Mischung von Schinken ist F12 und DMEM Medien mit 2,5 mM L-Glutamin ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin, 0,3 mg/mL G418 und 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) (V/V) für menschlichen Fötus hFOB 1.19 SV40 große T Antigen transfiziert Osteoblasten und McCoys 5A Medium mit 1,5 mM L-Glutamin ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/…

Representative Results

TEM-EDX erlaubt, für die in-vitro- Bildgebung der Matrix Vesikel (MVs) durch Mineralisierung Zellen freigesetzt und Mineralien produziert von MVs. die Ergebnisse mit diesem Verfahren zeigen, dass der Prozess der Mineralisierung kann abgewichen in verschiedenen Arten von Zellen. Die beiden Zelllinien erhielt die gleiche osteoblastischen Transdifferenzierung Behandlung, noch stimulierte Saos-2 Zellen mineralisierten effizienter als hFOB 1,19 Osteoblasten, wie AR-S belegt …

Discussion

In der aktuellen Zeitung beschrieben wir die Protokolle für AR-S Färbung, UV Licht Identifizierung von Fluorapatit und TEM-EDX in Vitro Imaging von MVs durch Mineralisierung Zellen freigesetzt und Mineralien produziert von MVs. Es ist möglich, alle Methoden, die oben genannten folgen einige allgemeine Schritte zur Problembehandlung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten mehrere kritische Schritte sorgfältig durchgeführt werden. Erstens ist es besser, hinzuzufügen, dass AA (das saure) gefolgt…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings