hFOB १.१९ और Saos-2: हम दो मानव हड्डी सेल लाइनों द्वारा जारी बुलबुले में खनिजों की स्थिति की तुलना करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । उनके mineralization प्रोफाइल Alizarin लाल-एस (ए. एस.) धुंधला, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश दृश्य, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग और ऊर्जा प्रसारक एक्स-रे microanalysis (EDX) द्वारा विश्लेषण किया गया ।
hFOB १.१९ और Saos-2: यह वीडियो ऊर्जा फैलाव एक्स-रे microanalysis (उनि-EDX) के साथ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग दो मानव हड्डी सेल लाइनों द्वारा जारी बुलबुले में खनिजों की स्थिति की तुलना करने के लिए प्रस्तुत करता है । इन सेल लाइनों, ascorbic एसिड (ए. ए.) और β-glycerophosphate (β-जीपी) के साथ उपचार के बाद, mineralization के लिए प्रसार से पूरा osteogenic transdifferentiation गुजरना और मैट्रिक्स बुलबुले (MVs) है कि ट्रिगर में एपेटाइट nucleation का उत्पादन extracellular मैट्रिक्स (ECM) ।
Alizarin लाल एस पर आधारित (AR-s) धुंधला और कोशिका lysates में पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश का उपयोग कर या बुलबुले में EDX quantitation और आयन मानचित्रण के बाद उनि इमेजिंग का प्रयोग करते हुए खनिजों की संरचना का विश्लेषण, हम अनुमान कर सकते है कि ऑस्टियो Saos-2 और osteoblastic hFOB १.१९ कोशिकाओं अलग mineralization प्रोफाइल प्रकट करते हैं । Saos-2 कोशिकाओं hFOB १.१९ कोशिकाओं से अधिक कुशलता से mineralize और बड़े खनिज जमा है कि यूवी प्रकाश के तहत दिखाई नहीं दे रहे हैं, लेकिन hydroxyapatite के समान है (हा) में है कि वे और अधिक सीए और एफ प्रतिस्थापन है ।
इन तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त परिणाम हमें समाप्त करने के लिए कि mineralization की प्रक्रिया अलग सेल प्रकार के आधार पर अनुमति देते हैं । हम प्रस्ताव है कि, सेलुलर स्तर पर, मूल और बुलबुले के गुण खनिजों के प्रकार का निर्धारण ।
अस्थि संयोजी ऊतक दो भागों से बना का एक प्रकार है: कार्बनिक (कोशिकाओं और कोलेजन फाइबर) और खनिज (कैल्शियम और फॉस्फेट यौगिकों) । हड्डियों में मुख्य खनिज अवयव१apatites होते हैं. अस्थियों में mineralization-सक्षम कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार (osteoblasts), दाँतों में (odontoblasts) और उपास्थि (chondrocytes) में mineralization मैट्रिक्स (extracellular) के प्रोटीन का उत्पादन करके ECM के आरंभिक चरणों को विनियमित करना और मैट्रिक्स जारी करना बुलबुले (MVs) (चित्रा 1) । MVs 100-300 एनएम व्यास बुलबुले कि कैल्शियम और फॉस्फेट जमा एपेटाइट nucleation की सुविधा और बाद में कोलेजन2,3को बांध रहे हैं । उसके बाद, MVs extracellular माध्यम को apatites जारी करने के लिए विखंडित । apatites कोलेजन फाइबर के साथ संपर्क में वृद्धि और अस्थि मैट्रिक्स के रूप में जारी है । mineralization extracellular माध्यम में Pi और Ca2 + की निरंतर आपूर्ति के द्वारा निरंतर किया जाता है । कुछ हाल ही में प्रकाशित डेटा हमारे मॉडल4,5समर्थन करते हैं । कोमल ऊतकों शारीरिक स्थितियों के तहत mineralize नहीं है । हालांकि, अस्थानिक पत्थराना रोग स्थितियों जैसे संवहनी पत्थराना3के तहत हो सकता है । संवहनी कोशिकाओं है कि osteoblast phenotype प्राप्त MVs का उत्पादन कर सकते है कि nucleation apatites के प्रेरित और औसत दर्जे का और mineralization की दीवार की परतों में intimal आरंभ रक्त वाहिकाओं । चूंकि अस्थानिक पत्थराना सामांय endochondral mineralization3के समान है, mineralization कोशिकाओं और osseous के chondrocytes के आणविक तंत्र को समझने कोमल ऊतकों के अस्थानिक पत्थराना पर कुछ सुराग प्रदान करना चाहिए कि कर रहे है गठित.
कंकाल के ऊतकों के विकास के विभिंन एंजाइमों द्वारा विनियमित है, विकास कारकों, और प्रवर्तकों या mineralization के अवरोधकों । ऊतक के विरोधी कार्रवाई-गैर-विशिष्ट alkaline फॉस्फेट (TNAP) (चित्रा 1) और ectonucleotide pyrophosphatase/फोस्फोडाईस्टेरेज मैं (NPP1), ankyrin (ांक) के साथ एक साथ, नियंत्रण अकार्बनिक pyrophosphate (पीपीमैं) एकाग्रता 6. पीपीमैं, हा गठन के एक शक्तिशाली अवरोधक, TNAP द्वारा hydrolyzed है; NPP1 hydrolyzes न्यूक्लियोटाइड triphosphates को फार्म पीपीi के दौरान ांक निर्यात पीपीi को सेल से ECM । Pi/पीपीआई अनुपात एपेटाइट गठन7,8 संभावित रोग परिणाम9के साथ विनियमित कर सकते हैं ।
एमवी झिल्ली nucleation प्रक्रिया (चित्रा 1) के दौरान MVs के अंदर कैल्शियम और फॉस्फेट की प्रारंभिक वर्षा की सुविधा है कि आयन परिवहन प्रोटीन में समृद्ध है. फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर 1 (गड्ढे)मैं MVs10,11में perivesicular अंतरिक्ष में उत्पन्न पी को शामिल करने में मदद करता है. Annexins में शामिल किया जा सकता है बाध्यकारी और परिवहन के Ca2 + और में शुरू होता है कि mineralization में है कि एमवी12,13लुमेन । हम परिकल्पना एहसान, पहले का सुझाव दिया, के भीतर mineralization के लिए एपेटाइट के आंतरिक nucleation के बुलबुले के अंदर ECM14,15में इसके प्रचार से पहले intracytoplasmic । इन विट्रो मॉडलिंग में सीए की प्रेरण2 +/Pमैं proteoliposomes में परिसरों पी एस और16AnxA5 से बने निर्माण की पुष्टि की । यह संकेत हो सकता है कि सीए के संचय2 +, पीमैं, AnxA5 और पुनश्च परिसरों microvilli की लिपिड बेड़ी में membranesrepresent की तरह nucleation कोर (नेकां) एपेटाइट के भीतर एमबनाम Annexins और TNAP भी कोलेजन के अधिकारी-बाध्यकारी क्षमता है कि कोलेजन फाइबर के साथ MVs रखने में सहायक हो सकता है और, ECM में mineralization के प्रसार उत्तेजक में । Fetuin एक और osteopontin (OPN)17, एपेटाइट गठन के अवरोधकों के रूप में जाना जाता है कि नीचे कोलेजन पाड़ पर mineralization के प्रसार को धीमा कर सकते हैं । Nucleation और प्रचार अलग घटनाओं रहे हैं, पूर्व पूर्ववर्ती उत्तरार्द्ध, और दोनों रोग mineralization की प्रक्रिया के लिए प्रासंगिक हो सकता है ।
खोजने के लिए कैसे कैल्शियम फॉस्फेट परिसरों के रसायन विज्ञान शारीरिक mineralization और अस्थानिक पत्थराना बदल सकते हैं, यह कोशिकाओं द्वारा उत्पादित खनिजों की पहचान करने के लिए आवश्यक है. Apatites सामान्य क्रिस्टल इकाई सेल फॉर्मूला सीए10(पीओ4)6एक्स2, जहां एक्स = सीएल, एफ, ओह के साथ कैल्शियम और फॉस्फेट युक्त खनिजों का एक समूह है । वे निम्नानुसार वर्गीकृत कर रहे हैं18: fluorapatite (एफए) सीए10(पीओ4)6एफ2, chlorapatite (सीए) सीए10(पीओ4)6सीएल2 और hydroxyapatite (हा) सीए10(पीओ4 )6(OH)2.
osteoblast सेल लाइनों का चुनाव खनिज गठन प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से प्रत्येक सेल लाइन mineralization का एक विशिष्ट प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करता है । इस रिपोर्ट में, हम mineralization के दो चयनित मानव कोशिका मॉडल: osteoblastic hFOB १.१९ कोशिकाओं और ऑस्टियो Saos-2 कोशिकाओं द्वारा खनिजों के nucleation की तुलना में । ऑस्टियो-व्युत्पन्न कोशिकाओं आमतौर पर osteoblastic मॉडल और Saos-2 कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जाता है सबसे परिपक्व osteoblastic चरित्र19 संरक्षित है, जबकि विभेदित मानव भ्रूण hFOB कोशिकाओं को व्यापक रूप से सामान्य osteoblastic के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं विभेद20. Alizarin लाल-s (AR-s) धुंधला, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश दृश्य, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग, ऊर्जा फैलाव एक्स-रे microanalysis (EDX) quantitation, और आयन: उनके mineralization प्रोफाइल अलग तरीकों से विश्लेषण किया गया मैपिंग. पिछले अध्ययनों में प्रयुक्त वैकल्पिक तकनीकों पर उनि-EDX का लाभ यह है कि यह एपेटाइट क्रिस्टल में आयन प्रतिस्थापन की मात्रात्मक और गुणात्मक परिणाम देता है4,5,21. उनि-EDX का उपयोग करने के समग्र लक्ष्य को इमेजिंग और mineralization प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान कोशिकाओं के विभिंन प्रकार से विभिंन खनिजों में सीए, एफ और सीएल आयनों के वितरण के ठहराव के लिए एक सरल तरीका मिल गया था । इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, उदाहरण के लिए, एक साथ रसायन और जलीय जीवों पर उनके संयुक्त प्रभाव के साथ जिंक नैनोकणों की बातचीत की निगरानी के लिए22। एक अंय अध्ययन में, टाइटेनियम सामग्री पर एक तांबे photocatalyst जलीय समाधान में बड़े पैमाने पर inductively युग्मित प्लाज्मा ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-OES), N2 physisorption (बेट), XRD, यूवी की तुलना डीआरएस, एफटी-IR, रमन के माध्यम से की विशेषता थी स्पेक्ट्रोस्कोपी, उनि-EDX, व photoelectrochemical माप23. हमारा उद्देश्य मूल और दो सेल लाइनों में बुलबुले और खनिजों के गुणों की तुलना तंत्र है कि नियंत्रण osseous भेदभाव के दौरान mineralization समझ गया था ।
चित्रा 1 . osseous कोशिकाओं में mineralization के प्रारंभिक चरणों की योजना extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन और झिल्ली से मैट्रिक्स बुलबुले (MVs) के रिलीज के संश्लेषण को शामिल। MVs कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन की कार्रवाई के माध्यम से कैल्शियम जमा, annexins और फॉस्फेट, एक अकार्बनिक फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर की कार्रवाई के माध्यम से (गड्ढे) ऊतक गैर विशिष्ट alkaline फॉस्फेट (TNAP) की गतिविधि के बाद, जो dephosphorylates पीपीमैं पीमैं, जिससे एपेटाइट nucleation सुविधा । फिर, MVs विखंडित और extracellular माध्यम apatites जारी । mineralization extracellular मीडियम4,5में Pi और Ca2 + की लगातार आपूर्ति के द्वारा निरंतर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
वर्तमान समाचार पत्र में, हम एआर के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन एस धुंधला, fluorapatite और उनि के यूवी प्रकाश पहचान-EDX इन विट्रो MVs के mineralizing कोशिकाओं और MVs द्वारा उत्पादित खनिजों के द्वारा जारी की इमेजिंग। यह कुछ स?…
The authors have nothing to disclose.
एमके और पूछो मैनुअल संचालन और पौंड तैयार चित्र प्रदर्शन किया और फिल्म बना दिया । पूछने पर पांडुलिपि लिखी, पौंड की पटकथा लिखी और मनोज ने टेबुल तैयार किया । एसएम, आरबी और एसपी गंभीर ने टेबुल, लिपि और पांडुलिपि पढ़ी । लेखक ultramicrotomy के साथ उसे उत्कृष्ट सहायता के लिए हैना Chomontowska धंयवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Szymon Suski और Henryk Bilski के साथ उनके उत्कृष्ट सहायता के लिए उनि-EDX विश्लेषण । लेखक के निर्देश रिकॉर्डिंग के लिए पेशेवर अंग्रेजी भाषा सुधार और बारबरा Sobiak के लिए डॉ पैट्रिक पेड़ों शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
यह काम अनुदान एन N401 १४०६३९ द्वारा विज्ञान और उच्च शिक्षा के पोलिश मंत्रालय से, पूछने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, पोलैंड 2016/23/n/NZ4/03313 to LB और 2016/23/n/NZ1/02449 से एमके, EU FP7 परियोजना की कल्पना : अनुसंधान नवाचार और शिक्षा में जैव इमेजिंग, GA No. २६४१७३, और प्रायोगिक जीवविज्ञान के Nencki संस्थान के सांविधिक कोष द्वारा, पोलिश विज्ञान अकादमी ।
Reagent | |||
Ham’s DMEM/F12 media mixture | PAA | E15-813 | 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372) |
McCoy’s 5A medium | PAA | E82312-0025 | for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85) |
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) | Sigma | P0781-100ML | 100 U/mL each |
G-418 | Sigma | 68168 | 0.3 mg/mL |
FBS | Gibco | 10270 | 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2 |
AA | Sigma | A-5960 | 50 µg/mL |
ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7.5 mM |
Bio-Gel HTP Gel | Bio-Rad | 130-0420 | for HA |
FA | synthesized by us | ||
CA | synthesized by us | ||
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture | Sigma | S7907/S8282 | 0.1 M, pH 7.2 |
PBS | pH 7.0, prepared by us | ||
AR-S in PBS | Sigma | A5533-25G | 0.5 g/100 mL, pH 5.0 |
Collagenase type IA | Sigma | C2674 | 500 U/mL |
SCL buffer | prepared by us | ||
Deionized wather | produced by us | ||
Ethanol | POCh | BA6480111 | absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90% |
Uranyl acetate in 50% ethanol | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0.25 g/10 mL |
PD medium | pH 7.4, prepared by us | ||
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) | Sigma | 158127/G-6257 | 3%:1% |
Post-fixation OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
LR White resin in ethanol | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2, 1:1, 100% |
Acetone | CHEMPUR | 111024800 | pure |
Tool | |||
Cryogenic vials | Corning Inc. | 430487 | 1.2 mL |
Plastic Petri culture dishes | Falcon | 353003 | 100 mm |
Plastic tubes | Falcon | 352096 and 352070 | 15 and 50 mL |
Serological pipettes | Falcon and VWR | 357521 and 612-3700 | 1 and 10 mL |
Plastic microcentrifuge tubes | Sigma | Z688312 and Z628034 | 1.5 mL black and 2 mL transparent |
Plastic tips | VWR | 613-0364, 613-0239 and 613-1050 | 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue |
Plastic racks | Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes |
Laminar Hera Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822) |
Incubators Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2 |
Fume hood | POLON | WCS-2 | for TEM stainings |
Glass bottles | SIMAX | 1632414501050 and 1632414501100 | 50 and 100 mL |
Quartz glass tubes | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 mm |
Pump | IBS Integra Biosciences | VACUSAFE comfort | for vacuum |
Oven | Memmert | UNE 400 | 56°C |
Porcelain multi-well plate | Rosenthal technik | 229/12 | 12 wells |
Glass beakers | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
Glass bottles | Pocord | DIN22 | 10 mL |
Plastic box | Agar Scientific Ltd. | for darkness | |
Snap Fit Gelatin Capsules | Agar Scientific Ltd. | G3741 | size 1 |
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box | Agar Scientific Ltd. | S162N3 | film on the shiny side |
Silicon cell scraper | Sigma | SIAL0010-100EA | size 1.8/25 cm |
Syringe with needle | BogMark | 007 | syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16 |
Syringe | Chirana | CH005L | 5 mL |
Centrifuge | MPW Medical Instruments | MPW-350R | 130 x g and 500 x g |
UV transluminator | UVP | M-20 | for visible and UV light |
Ultramicrotome | LKB | NOVA | 700Å sections |
Block holder | LKB | E6711 | round shape |
Diamond knife | DiATOME | Ultra 45° | size 3 |
Eyelash holder | bovine, prepared by us | ||
Forceps | ROTH | 2855.1 | antistatic for grids |
Spatulas set | ROTH | E286.1 | antistatic for powders |
Imaging | |||
Inverted Light Microscope | Zeiss with Canon | AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 | Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters |
Transmission Electron Microscope | TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus | JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera | magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX |
Camera body and lenses | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D |
for movie recordings |
Microphone | MXL Mics | Tempo | for voice recordings |