미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석

Summary

선물이 두 인간의 뼈 세포 선으로 발표 하는 소포에 미네랄의 상태를 비교 하는 프로토콜: hFOB 1.19와 Saos-2. 그들의 강화 프로 파일에 의해 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 및 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX)을 분석 했다.

Abstract

이 비디오 전송 전자 현미경 검사 법의 사용 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis을 소포 두 인간의 뼈 세포 라인에 의해 발표에서 미네랄의 상태를 비교할 (가장 EDX) 선물: hFOB 1.19와 Saos-2. Ascorbic 산 (AA)와 β-glycerophosphate (β-GP), 치료 후 이러한 셀 라인 강화를 확산에서 완전 한 osteogenic transdifferentiation를 받아야 매트릭스 소포 (MVs)에서 인회석 nucleation 트리거하는 생산 하 고는 세포 외 매트릭스 (ECM)입니다.

알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩 및 미네랄 자외선 (UV)를 사용 하 여 세포 lysates 또는 소포 편 이미징 EDX 정량 및 이온 매핑을 사용 하 여 구성의 분석을 바탕으로, 우리가 그 다리를 유추할 수 Saos-2 그리고 osteoblastic hFOB 1.19 셀 별개 강화 프로필 공개. Saos-2 셀 hFOB 1.19 셀 보다 더 효율적으로 형성할 고 생산 자외선 아래 표시 되지 않습니다 하지만 비슷합니다 hydroxyapatite (HA) 들은 더 많은 Ca와 F 대체에 큰 무기물 예금.

이러한 기술을 사용 하 여 얻은 결과 수 결론 강화 작용 과정 세포 유형에 따라 다릅니다. 우리는, 세포 수준에서 기원과 vesicles의 속성 미리 미네랄의 종류를 제안 합니다.

Introduction

뼈는 두 부분으로 구성 된 결합 조직: 유기 (세포와 콜라겐 섬유)과 미네랄 (칼슘, 인산 화합물). 뼈에 주요 미네랄 구성 요소는 apatites¹. 다른 종류의 강화 유능한 세포 뼈 (osteoblasts), 치아 (odontoblasts)와 연골 (chondrocytes) 규제 강화의 초기 단계는 세포 외 기질 (ECM)의 단백질을 생산 하 고 매트릭스를 발표 하 여 소포 (MVs) (그림 1). MVs는 100-300 nm 직경 소포 칼슘과 인회석 nucleation 촉진 인산 축적 하 고 그 후 콜라겐^2,3를 바인딩할. 다음, MVs extracellular 매체에 apatites를 풀어 분해. apatites 계속 콜라겐 섬유 접촉 성장과 뼈 매트릭스를 형성 합니다. 강화 작용은 P_나 및 캘리포니아^{2 +} 세포 외 매체에서의 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 최근 게시 된 데이터 지원 우리의 모델^4,5. 부드러운 조직 생리 적인 조건 하에서 형성할 하지 않습니다. 그러나, 소성 석 회화는 혈관 석 회화³같은 병 적인 조건 하에서 발생할 수 있습니다. 혈관 세포 osteoblast 형 취득 apatites의 nucleation 유발 하 고 혈관 벽의 중간과 내 층에서 강화 작용을 시작 하는 MVs를 생성할 수 있습니다. 소성 석 회화부터 정상적인 endochondral 강화³, 뼈가 있는 세포의 강화 작용의 분자 메커니즘을 이해와 chondrocytes는 부드러운 조직의 소성 석 회화에 몇 가지 단서를 제공 한다 형성.

골격 조직 개발은 다양 한 효소, 성장 요인, 발기인 또는 강화 작용의 억제제에 의해 통제 된다. 반목 행동 조직-특이 현상 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP) (그림 1)와 ectonucleotide pyrophosphatase/포스의 난 (NPP1), 함께 ankyrin (ANK), 제어 (PP_i) 무기 파이 인산 농도 ⁶. PP_나, 하 대형의 강력한 억제제 TNAP;에 의해 분해 되 NPP1 hydrolyzes 뉴클레오티드 PP_나 ANK ECM에 PP_나 를 셀에서 수출 하는 동안 형성 된. Pi/PPi 비율 인회석 형성^7,8 병 적인 결과⁹를 조절할 수 있습니다.

MV 막 nucleation 프로세스 (그림 1) 중 칼슘과 인산 염 MVs 안쪽의 초기 강수량을 용이 하 게 이온 수송 단백질 농축입니다. 인산 염 운송업 자 1 (구 덩이) P_나 MVs^10,11perivesicular 공간에 생성을 통합 하는 데 도움이 됩니다. Annexins는 MV 루멘^12,13강화 작용을 시작 하는 생물 과정에서 바인딩 및 캘리포니아^{2 +} 의 전송에 관련 될 수 있습니다. 우리는 가설, 이전, ECM^14,15에서 전파 하기 전에 뮤직 비디오 안에 인회석의 내부 nucleation의 intracytoplasmic 소포 내에서 강화에 대 한 제안 부탁. 생체 외에서 모델링 캘리포니아^{2 +}/P_나 단지 형성 PS 및 AnxA5¹⁶에서 만든 proteoliposomes에서의 유도를 확인 했다. 이 그 축적을 나타낼 수 있습니다의 캘리포니아^{2 +}, P_나, microvilli 같은 membranesrepresent M대 Annexins와 TNAP는 인회석의 nucleation 코어 (NC)의 지질 뗏목에서 AnxA5 및 PS 단지 또한 콜라겐 바인딩 보유 강화는 ECM에서의 전파를 자극, 그리고 콜라겐 섬유를 따라 MVs에 도움이 될 수 있는 용량 Fetuin A와 osteopontin (OPN)¹⁷, collagenous 비 계에 강화 작용의 전파를 저하 시킬 수 있습니다 인회석 형성 억제제로 알려져 있습니다. Nucleation 및 전파는 고유한 이벤트, 후자, 앞 전 고 모두 병 적인 강화 작용의 과정에 대 한 관련성이 있을 수 있습니다.

어떻게 칼슘 인산 염 복합물의 화학 생리 강화 및 소성 석 회화 변경 될 수 있습니다 발견, 그것은 세포에 의해 생산 하는 광물을 식별 하는 데 필요한. Apatites 칼슘 및 인산 염 무기물 일반 크리스탈 단위 셀 수식 Ca₁₀(PO₄)₆X₂를 포함 하는 그룹, 어디 X = Cl, F, 오하이오. 그들은¹⁸를 다음과 같이 분류 된다: fluorapatite (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ , hydroxyapatite (HA) Ca₁₀(포₄ )₆(OH)₂.

광물의 형성을 유발 하 osteoblast 셀 라인의 선택은 각 셀 라인 강화 작용의 독특한 프로필을 전시 하기 때문에 중요 한. 이 보고서에서 우리는 강화 작용의 두 가지 선택 된 인간 세포 모델에 의해 미네랄의 nucleation 비교: osteoblastic hFOB 1.19 셀과 다리 Saos-2 셀. Osteosarcoma 파생 셀 osteoblastic 모형으로 상용 되 고 Saos-2 셀 가장 성숙한 osteoblastic 문자¹⁹ 보존 undifferentiated 인간의 태아 hFOB 세포는 정상 osteoblastic 모델로 널리 사용 감 별 법²⁰. 다른 방법으로 그들의 강화 프로 파일 분석 했다: 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징, 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 정량, 및 이온 매핑. 이전 연구에서 사용 되는 대체 기술 가장 EDX의 이점을 준다는 것 이온 교체의 양적 및 질적 결과 인회석 결정^4,,521입니다. 가장 EDX를 사용 하 여 전반적인 목표 이미징 및 강화 프로세스의 고유 단계 동안 다른 종류의 세포에서 다양 한 미네랄에서 Ca, F 및 Cl 이온의 분포의 정량화에 대 한 간단한 방법을 찾으려고 했다. 이 메서드는 성공적으로 사용 되었습니다, 예를 들어 공존 화학 물질과 아연 나노 입자 및 수생 생물²²에 그들의 결합된 효과의 상호 작용을 모니터링. 또 다른 연구에서는 구리 촉매 용액에서 티타늄 소재에 광범위 하 게 유도 결합된 플라즈마 광 방출 분 광 분석 (ICP OES), N2 physisorption (내기)에 의해 특징 이었다 XRD, UV에 대 한 DRS FT-적외선, 라만 분광학, 편-EDX, 및 화학적 측정²³. 우리의 목표는 근원 및 소포 및 미네랄 뼈가 있는 차별화 동안 강화 작용을 제어 하는 메커니즘을 이해 하 두 셀 라인의 속성을 비교 했다.

그림 1 . 뼈가 있는 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 종합 및 막에서 매트릭스 소포 (MVs)의 출시에에서 강화의 초기 단계의 계획. MVs 칼슘 묶는 단백질, annexins 및 인산, 무기 인산 염 운송업 자 (구 덩이)의 행동을 통해 조직의 일반적인 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP), dephosphorylates는의 활동에 의해 다음의 행동을 통해 칼슘 축적 PP_나 를 P_나, 따라서 인회석 nucleation 촉진. 그런 다음, MVs 분해 하 고 extracellular 매체에 apatites를 출시. 강화 작용은 P_나 및 캘리포니아^{2 +} extracellular 매체^4,5에서 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1. 세포 배양 및 치료 층 류 두건 아래 모든 필요한 자료를 넣고 아래 자외선 소독. 문화 미디어는: 1:1 혼합물 햄의 F12 및 DMEM 미디어 2.5 m L-글루타민 보충 100 U/mL 페니실린와 100 U/mL 스, 0.3 mg/mL G418 10% 소 태아 혈 청 (FBS) (v/v) 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 큰 T 항 원 페에 대 한 osteoblasts, 그리고 맥 코이 5A 매체 1.5 m L-글루타민 보충과 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 15 S (v/v) 인간의 다리 Saos-2 셀. 5% …

Representative Results

가장 EDX 체 외에 이미징 매트릭스 소포 (MVs) 셀 mineralizing 발표와 M대 강화 작용의 과정을 다르게 진행할 수 있습니다이 기술을 사용 하 여 얻은 결과 입증 하 여 생산 하는 미네랄의 수 에 셀의 다양 한 종류. 두 셀 라인 같은 osteoblastic transdifferentiation 치료를 받은 아직 자극된 Saos-2 셀 mineralized hFOB 보다 더 효율적으로 1.19 osteoblasts 아칸소-S에 의해 입증으로 얼룩…

Discussion

현재 신문에서 우리에 대 한 아칸소-얼룩, fluorapatite의 UV 빛 식별 프로토콜을 설명 하 고 가장 EDX 체 외에 이미징 MVs 셀 mineralizing 발표와 미네랄의 MVs. 에 의해 생산 그것은 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계에 따라 위에서 언급 한 모든 메서드를 해결 수 있습니다. 최적의 결과 얻으려면 몇 가지 중요 한 단계는 신중 하 게 수행 되어야 한다. 첫째, 그것은 AA (산 성) 인 β-GP (알칼리 성) ?…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings