Analyse av mineraler produsert av hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjelp av overføring elektronmikroskop med energi dispersiv X-ray Microanalysis

Summary

Vi presenterer en protokoll for å sammenligne tilstanden til mineraler i blemmer utgitt av to menneskelig bein linjer: hFOB 1,19 og Saos-2. Deres mineralisering profiler ble analysert av Alizarin Red-S (AR-S) flekker, ultrafiolett (UV) lys visualisering, overføring elektronmikroskop (TEM) bildebehandling og energi dispersiv X-ray microanalysis (EDX).

Abstract

Denne videoen viser bruk av overføring elektronmikroskop med energi dispersiv X-ray microanalysis (TEM-EDX) å sammenligne tilstanden av mineraler i blemmer utgitt av to menneskelig bein linjer: hFOB 1,19 og Saos-2. Disse linjer, etter behandling med askorbinsyre (AA) og β-glycerophosphate (β-GP), gjennomgå komplett osteogenic transdifferentiation fra spredning til mineralisering og produsere matrix blemmer (MVs) som utløser apatitt nucleation i den ekstracellulær matrix (EFM).

Basert på Alizarin Red-S (AR-S) flekker og analyse av sammensetningen av mineraler i celle lysates med ultrafiolett (UV) lys eller blemmer med TEM imaging etterfulgt av EDX kvantifisering og ion kartlegging, kan vi antyde at osteosarcoma Saos-2 og osteoblastic hFOB 1,19 celler avsløre distinkte mineralisering profiler. SAOS-2 celler mineralize mer effektivt enn hFOB 1,19 celler og produsere større mineralforekomster som vises ikke under UV lys, men som ligner på hydroxyapatite (HA) ved at de har flere Ca og F erstatninger.

Resultatene disse teknikkene tillater oss å konkludere med at prosessen med mineralisering varierer avhengig celle. Vi foreslår at på cellenivå, opprinnelse og egenskaper av blemmer forhåndsbestemme av mineraler.

Introduction

Ben er en type bindevev består av to deler: organisk (celler og kollagen fibrene) og mineral (kalsium og fosfat forbindelser). Mineral hovedkomponentene i bein er direkte oversatt: apatitter¹. Ulike typer mineralisering kompetente celler i bein (osteoblasts), tenner (odontoblasts) og brusk (chondrocytes) regulere forbokstaven skritt av mineralisering av produserer proteiner av den ekstracellulære matrisen (ECM) og slippe matrise blemmer (MVs) (figur 1). MVs er 100-300 nm diameter blemmer som akkumuleres kalsium og fosfat tilrettelegge apatitt nucleation og deretter binde kollagen^2,3. Deretter nedbryte MVs for å løslate direkte oversatt: apatitter til ekstracellulære medium. De direkte oversatt: apatitter fortsette å vokse i kontakt med kollagen fibrene og danne bein matrix. Mineraliseringen er påført konstante tilførselen av P_jeg og Ca^{2 +} i ekstracellulære medium. Noen nylig publiserte data støtte vår modell^4,5. Myke vev ikke mineralize under fysiologiske forhold. Ektopisk forkalkninger kan imidlertid oppstå under patologiske tilstander som vaskulær forkalkninger³. Vaskulære celler som kjøper osteoblast fenotypen kan produsere MVs som induserer nucleation av direkte oversatt: apatitter og starte mineralisering i mediale og intimal lagene på veggen av blod fartøy. Siden ektopisk forkalkninger ligne normal endochondral mineralisering³, forstå molekylære mekanismer av mineralisering av osseous celler og chondrocytes bør gi noen hint om ektopisk forkalkning av mykt vev som er dannet.

Utvikling av skjelettet vev er regulert av ulike enzymer, vekstfaktorer, og arrangører og hemmere av mineralisering. Handlingen antagonistiske vev-uspesifikke alkalisk fosfatase (TNAP) (figur 1) og ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesterase jeg (NPP1), sammen med ankyrin (ANK), styrer uorganiske pyrophosphate (PP_jeg) konsentrasjon ⁶. PP_jeg, en potent hemmer av HA formasjon, er hydrolyzed av TNAP; NPP1 hydrolyzes nucleotide triphosphates å danne PP_jeg mens ANK eksporterer PP_jeg fra cellen til ECM. Pi/PPT forholdet kan regulere apatitt formasjon^7,8 med mulige patologisk konsekvenser⁹.

MV membranen er beriket i ion transport proteiner som letter første nedbør av kalsium og fosfat inne MVs under nucleation prosessen (figur 1). Den fosfat transporter 1 (PiT) bidrar til å innlemme P_jeg generert i perivesicular plass i MVs^10,11. Annexins kan være involvert i bindingen og transport av Ca^{2 +} og Biofysiske prosessen som starter mineralisering i MV lumen^12,13. Vi ønsker hypotesen foreslått tidligere mineralisering innen Intracytoplasmatisk blemmer av interne nucleation av apatitt inne MV før sin forplantning i ECM^14,15. In vitro modellering bekreftet induksjon av Ca^{2 +}/P_jeg komplekser formasjon i proteoliposomes laget av PS og AnxA5¹⁶. Dette kan tyde på at opphopning av Ca^{2 +}, P_jeg, AnxA5 og PS komplekser i lipid flåter av microvilli-lignende membranesrepresent nucleation kjernen (NC) i apatitt Mvs Annexins og TNAP har kollagen-bindende kapasitet som kan være nyttig i å plassere MVs langs kollagenfibre og stimulere utbredelsen av mineralisering i ECM. Fetuin A og osteopontin (OPN)¹⁷, kalles hemmere av apatitt formasjon som kan forsinke spredning av mineralisering på collagenous skafottet. Begge kan være relevante for prosessen med patologisk mineralisering nucleation og overføring er forskjellige arrangementer, tidligere foran sistnevnte.

For å oppdage hvordan kjemien i kalsium fosfat komplekser kan endre fysiologiske mineralisering og ektopisk forkalkninger, er det nødvendig å identifisere mineraler produsert av cellene. Direkte oversatt: apatitter er en gruppe av kalsium og fosfat som inneholder mineraler med generelle krystall enheten cellen formelen Ca₁₀(PO₄)₆X₂, der X = Cl, F, OH. De er klassifisert som følger¹⁸: fluorapatite (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ og hydroxyapatite (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

Valget av osteoblast linjer å skape mineral er viktig, siden hver celle linje viser en tydelig profil av mineralisering. I denne rapporten vi sammenlignet nucleation av mineraler av to valgte human celle modeller av mineralisering: osteoblastic hFOB 1,19 cellene og osteosarcoma Saos-2. Osteosarcoma-avledet celler brukes ofte som osteoblastic og Saos-2 celler har bevart de fleste eldre osteoblastic karakter¹⁹ mens udifferensierte menneskelige føtal hFOB celler er mye brukt som modell for vanlig osteoblastic differensiering²⁰. Deres mineralisering profiler ble analysert av ulike metoder: Alizarin rød-S (AR-S) flekker, ultrafiolett (UV) lys visualisering, overføring elektronmikroskop (TEM) bildebehandling, energi dispersiv X-ray microanalysis (EDX) kvantifisering og ion tilordning. Fordelen med TEM-EDX over alternative teknikker som brukes i tidligere studier er at det gir kvantitative og kvalitative resultatene av ion erstatning i apatitt krystaller^4,5,21. Det overordnede målet med å bruke TEM-EDX var å finne en enkel metode for bildebehandling og kvantifisering av fordelingen av Ca, F og Cl ioner i ulike mineraler fra forskjellige celler i forskjellige stadier av mineralisering. Denne metoden har blitt brukt, for eksempel for overvåking samspillet av sink nanopartikler coexisting kjemikalier og deres kombinerte effekten vannlevende organismer²². I en annen studie, en kobber photocatalyst på Titan materialer i vandig løsningen var mye preget med Induktivt kombinert plasma optisk utslipp massespektrometri (ICP-OES), N2 physisorption (innsats), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spektroskopi og TEM-EDX photoelectrochemical målinger²³. Vårt mål var å sammenligne opprinnelse og egenskaper av blemmer og mineraler i to linjer å forstå mekanismen som styrer mineralisering under osseous differensiering.

Figur 1 . Ordningen av de første trinnene av mineralisering i osseous celler syntesen av ekstracellulær matrix (EFM) proteiner og utgivelsen av matrix blemmer (MVs) fra membranen. MVs samle kalsium handlingen av kalsium bindende proteiner, annexins og fosfat, gjennom handling av en uorganisk fosfat transporter (PiT) etterfulgt av aktiviteten til vev ikke-spesifikk alkalisk fosfatase (TNAP), som dephosphorylates PP_jeg P_jeg, og dermed tilrettelegge apatitt nucleation. Deretter MVs oppløsning og slipp direkte oversatt: apatitter til ekstracellulære medium. Mineraliseringen er påført konstante tilførselen av P_jeg og Ca^{2 +} i ekstracellulære middels^4,5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. celle kultur og behandling Sett alle nødvendige materialer under laminær strømning panseret og sperre under UV-lys. Kultur medier: en 1:1 blanding av Ham er F12 og DMEM medier med 2,5 L-glutamin supplert med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 0,3 mg/mL G418 og 10% fosterets Bovine Serum (FBS) (v/v) for menneskelige fosteret hFOB 1,19 SV40 store T antigen transfekterte osteoblasts og McCoys 5A medium med 1,5 mM L-glutamin supplert med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin og 15% FBS (v/v) for…

Representative Results

TEM-EDX tillater i vitro avbilding av matrix blemmer (MVs) utgitt av mineralizing celler og mineraler produsert av Mvs resultatene ved hjelp av denne teknikken viser at prosessen med mineralisering kan fortsette annerledes i ulike typer celler. De to linjene fikk samme osteoblastic transdifferentiation behandling, men stimulert Saos-2-celler mineralized mer effektivt enn hFOB 1,19 osteoblasts, noe som gjenspeiles av AR-S flekker (figur 2). D…

Discussion

I dagens papir, vi beskrev protokollene for AR-S flekker, UV lys identifikasjon av fluorapatite og TEM-EDX i vitro imaging MVs utgitt av mineralizing celler og mineraler produsert av MVs. Det er mulig å løse alle metodene ovenfor ved å følge noen felles feilsøkingstrinn. For å oppnå optimale resultater, skal flere viktige trinn utføres nøye. Først er det bedre å legge AA (som er surt) etterfulgt av β-GP (som er alkalisk) Hvis du vil beholde pH 7.4 i kultur medium. Andre, etter AR-S flekker, …

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings