Analys av mineraler produceras av hFOB 1.19 och Saos-2 celler använder transmissionselektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray mikroanalys

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att jämföra staten av mineraler i blåsor släpptes av två mänskliga ben cellinjer: hFOB 1.19 och Saos-2. Sina mineralisering profiler analyserades av Alizarin Red-S (AR-S) färgning, ultraviolett (UV) ljus visualisering, överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging och energy dispersive X-ray mikroanalys (EDX).

Abstract

Denna video presenterar användning av transmissionselektronmikroskopi med energy dispersive X-ray mikroanalys (TEM-EDX) att jämföra staten av mineraler i blåsor släpptes av två mänskliga ben cellinjer: hFOB 1.19 och Saos-2. Dessa cellinjer, efter behandling med askorbinsyra (AA) och β-glycerofosfat (β-GP), genomgå fullständig osteogent transdifferentiation från spridning till mineralisering och producera matrix blåsor (MVs) som utlöser apatit kärnbildning i den extracellulär matrix (ECM).

Baserat på Alizarin Red-S (AR-S) färgning och analys av sammansättning av mineraler i cell lysates med ultraviolett (UV) ljus eller blåsor med hjälp av TEM imaging följt av EDX kvantifiering och ion kartläggning, vi kan dra slutsatsen att osteosarkom Saos-2 och osteoblastiska hFOB 1.19 celler avslöja distinkta mineralisering profiler. SAOS-2-celler mineralize mer effektivt än hFOB 1.19 celler och producera större mineralfyndigheter som inte är synligt i UV-belysning men liknar hydroxyapatit (HA) att de har mer Ca och F substitutioner.

De resultat som erhålls med hjälp av dessa tekniker tillåter oss att dra slutsatsen att processen för mineralisering skiljer sig beroende på cellen. Vi föreslår att på cellnivå, ursprung och egenskaper av blåsor förutbestämma vilken typ av mineraler.

Introduction

Ben är en typ av bindväv som består av två delar: ekologisk (celler och kollagenfibrer) och mineraler (kalcium och fosfat föreningar). Mineraliska huvudkomponenterna i ben är apatites¹. Olika typer av mineralisering-kompetenta celler i skelettet (osteoblaster), tänder (odontoblaster) och brosk (kondrocyter) reglera de första stegen av mineralisering av producerar proteiner av den extracellulär matrixen (ECM) och släppa matris blåsor (MVs) (figur 1). MVs är 100-300 nm diameter blåsor som ackumuleras kalcium och fosfat underlätta apatit kärnbildning och därefter binda till kollagen^2,3. Sedan, MVs upplösas för att släppa apatites till extracellulära medium. Apatites fortsätter att växa i kontakt med kollagenfibrer och bilda benmatrix. Mineraliseringen upprätthålls av den konstant tillförselen av P_jag och Ca^{2 +} i det extracellulära mediet. Några nyligen publicerade data stödjer vår modell^4,5. Mjuka vävnader inte mineralize under fysiologiska betingelser. Ektopisk förkalkning kan dock inträffa under sjukdomstillstånd såsom vaskulär förkalkning³. Vaskulära celler som förvärvar osteoblast fenotypen kan producera MVs som inducerar kärnbildning av apatites och initiera mineralisering i väggen mediala och intimans lager av blodkärl. Sedan ektopisk förkalkning likna normala endochondral mineralisering³, förstå de molekylära mekanismerna av mineralisering av bendefekter celler och kondrocyter bör ge några ledtrådar om ektopisk förkalkning av mjukvävnad som är bildas.

Utvecklingen av skelettet vävnader regleras av olika enzymer, tillväxtfaktorer, och initiativtagare eller hämmare av mineralisering. Åtgärden antagonistiska vävnad-ospecifik alkaliskt fosfatas (TNAP) (figur 1) och ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesteras jag (NPP1), tillsammans med ankyrin (ANK), styr oorganisk pyrofosfat (PP_jag) koncentration ⁶. PP_jag, en potent hämmare av HA bildandet, hydrolyseras av TNAP; NPP1 hydrolyserar nukleotid trifosfater bildar PP_jag medan ANK export PP_jag från cellen till ECM. Förhållandet Pi/PPi kan reglera apatit bildandet^7,8 med eventuella patologiska konsekvenserna⁹.

MV membranet är berikad i ion transportproteiner som underlättar inledande utfällning av kalcium och fosfat inuti MVs under processen kärnbildning (figur 1). Fosfat transportören 1 (PiT) hjälper till att införliva P_jag genereras i perivesicular utrymme till MVs^10,11. Annexins kan vara inblandade i bindningen och transport av Ca^{2 +} och biofysiska processen som initierar mineralisering i MV lumen^12,13. Vi gynnar den hypotesen, föreslog tidigare, för mineralisering inom intracytoplasmatisk blåsor av interna kärnbildning av apatit inuti MV innan dess förökning i ECM^14,15. In vitro modellering bekräftade induktion av Ca^{2 +}/P_jag komplex bildande i proteoliposomes gjorda av PS och AnxA5¹⁶. Detta kan tyda på att ansamling av Ca^{2 +}, P_jag, AnxA5 och PS komplex i lipid rafts av Mikrovilli-liknande membranesrepresent kärnbildning kärnan (NC) i apatite inom MVs. Annexins och TNAP också äger kollagen bindande kapacitet som kan vara till hjälp i att placera MVs längs kollagenfibrer och stimulera spridningen av mineralisering i ECM. Fetuin A och osteopontin (OPN)¹⁷, är kända som hämmare av apatit bildandet som kan bromsa förökningen av mineralisering på kollagena schavotten. Kärnbildning och förökning är separata händelser, den förstnämnda som föregår den senare, och båda kan vara relevanta för processen av patologiska mineralisering.

För att upptäcka hur kemin av kalciumfosfat komplex kan ändra fysiologiska mineralisering och ektopisk förkalkning, är det nödvändigt att identifiera de mineraler som produceras av celler. Apatites är en grupp av kalcium och fosfat som innehåller mineraler med den allmänna crystal enhet cell formeln Ca₁₀(PO₄)₆X₂, där X = Cl, F, OH. De klassificeras enligt följande¹⁸: Fluorapatit (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ och hydroxyapatit (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

Valet av osteoblast cellinjer att framkalla mineral bildas är avgörande, eftersom varje cellinje uppvisar en tydlig profil av mineralisering. I detta betänkande, Vi jämförde kärnbildning av mineraler av två valda mänsklig cellmodeller av mineralisering: osteoblastiska hFOB 1.19 och osteosarkom Saos-2 celler. Osteosarkom-derived celler används ofta som osteoblastiska modeller och Saos-2-celler har bevarat de mest mogna osteoblastiska karaktär¹⁹ medan odifferentierade mänskliga fostrets hFOB celler används allmänt som en modell för normal osteoblastiska differentiering²⁰. Sina mineralisering profiler analyserades av olika metoder: Alizarin Red-S (AR-S) färgning, ultraviolett (UV) ljus visualisering, överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging, energy dispersive X-ray mikroanalys (EDX) kvantifiering och ion kartläggning. Fördelen med TEM-EDX jämfört med alternativa tekniker som används i tidigare studier är att det ger kvantitativa och kvalitativa resultat av ion ersättare i apatite kristaller^4,5,21. Det övergripande målet med TEM-EDX var att hitta en enkel metod för avbildning och kvantifiering av fördelningen av Ca, F och Cl-joner i olika mineraler från olika typer av celler under olika faser av processen mineralisering. Denna metod har använts framgångsrikt, till exempel för att övervaka växelverkan av zink nanopartiklar med samtidiga kemikalier och deras kombinerade effekter på vattenlevande organismer²². I en annan studie, en koppar fotokatalysator på titanium material i vattenlösning präglades i stor utsträckning genom induktivt kopplad plasma OEC (ICP-OES), N2 physisorption (insats), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spektroskopi och TEM-EDX photoelectrochemical mätningar²³. Vårt syfte var att jämföra ursprung och egenskaper av blåsor och mineraler i två cellinjer att förstå mekanismen som styr mineralisering under bendefekter differentiering.

Figur 1 . Systematiken i de första stegen av mineralisering i bendefekter celler med syntesen av extracellulär matrix (ECM) proteiner och frisättning av matrix blåsor (MVs) från membranet. MVs ackumuleras kalcium genom åtgärder av kalcium bindande proteiner, annexins och fosfat, genom åtgärder av ett oorganiskt fosfat transportör (PiT) följt av aktiviteten av vävnad ospecifika alkaliska fosfataser (TNAP), som defosforylerar PP_jag att P_jag, därigenom underlätta apatit kärnbildning. Sedan MVs upplösas och släppa apatites till extracellulära medium. Mineraliseringen upprätthålls av den konstant tillförselen av P_jag och Ca^{2 +} i den extracellulära medium^4,5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. cell kultur och behandling Sätta allt nödvändigt material under laminärt flöde huven och sterilisera dem under UV-ljus. Kultur media är: en 1:1 blandning av skinka är F12 och DMEM media med 2,5 mM L-glutamin kompletteras med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 0,3 mg/mL G418 och 10% fetalt bovint Serum (FBS) (v/v) för mänskliga fostret hFOB 1.19 SV40 stora T-antigen transfekterade osteoblaster och McCoys medium 5A med 1,5 mM L-glutamin kompletteras med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomy…

Representative Results

TEM-EDX möjliggör av in vitro- imaging av matrix blåsor (MVs) utgivet mineraliserande celler och mineraler produceras av MVs. som de resultat som erhålls med hjälp av denna teknik Visa att processen för mineralisering kan gå vidare på olika sätt i olika typer av celler. De två cellinjer fick samma osteoblastiska transdifferentiation behandling, men stimuleras Saos-2-celler mineraliserad mer effektivt än hFOB 1.19 osteoblaster, som framgår av AR-S färgning (<…

Discussion

I det nuvarande papperet, beskrev vi protokollen för AR-S färgning, UV ljus identifiering av Fluorapatit och TEM-EDX in vitro- imaging av MVs släpptes av mineraliserande celler och mineraler produceras av MVs. Det är möjligt att ta itu med alla metoder som nämns ovan genom att följa vissa vanliga felsökningssteg. För att erhålla optimala resultat, bör flera kritiska moment utföras noggrant. Det första är det bättre att lägga AA (som är sura) följt av β-GP (som är basiskt) för att be…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings