利用 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins 快速简便地生成线虫基因组点突变体的管道
Summary
在这里, 我们提出了一个方法, 以工程的基因组的C. 线虫使用 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 和同源依赖修复模板。
Abstract
聚簇定期穿插回文重复 (CRISPR)-CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 原核自适应免疫防御系统已被联合选择作为一个强大的工具, 精确的真核基因组工程。在这里, 我们提出了一个快速和简单的方法, 使用嵌合体单导 rna (sgRNA) 和 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs), 以有效和精确地产生基因组点突变的C. 线虫。我们描述了一个 sgRNA 目标选择的管道, 同源定向修复 (HDR) 模板设计, CRISPR-Cas9-RNP 络合和交付, 以及一个基因分型策略, 使正确编辑的动物的健壮和快速识别。我们的方法不仅允许简单的生成和识别所需的基因突变动物, 而且还有助于在大约 4-5 天内检测其他复杂的 indel 等位基因, 效率高, 筛选工作量减少。
Introduction
最近的技术进步已经从根本上改变并加速了精确地设计基因组的能力。特别是, 依靠 RNA 引导的限制性 Cas9 在目标序列附近诱导双链断裂 (CRISPR-Cas9) 的系统, 已被广泛地用于精确地设计大多数模型生物体的基因组, 用于生物医学研究1,2,3,4。重要的是, 即使在诸如线虫5这样的困难物种中, CRISPR-Cas9 的使用也没有锁定基因组编辑。无论物种, 产生点突变与基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑系统依赖于三核心组件: 1) Cas9 限制性, 2) 一个单一的指南 RNA (sgRNA), 指示 Cas9 限制性到目标序列, 3) 用户设计同源定向修复 (HDR) 模板, 其中包含所需的感兴趣的编辑2。
有几种方法可用于将靶向 sgRNA 和 Cas9 核酸酶引入细胞, 包括质粒、RNA 和基于病毒的传递方法 6.最近, 在 CRISPR-Cas9-based 基因组编辑7中, 直接交付预复合 sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) 已成为一个强大而有效的工具。预复杂 CRISPR-Cas9 RNPs 的直接传递有几个明显的优点, 即: 1) RNPs 绕过细胞转录和翻译的需要, 2) RNPs 迅速清除, 这可能会增加特异性通过减少可用时间离靶解理和 3) RNPs 不包含外来的 DNA/RNA 元素, 通过随机积分绕过非本机序列引入宿主基因组。在一起, 这些属性可能会提供一个短暂的 CRISPR 的目标编辑, 同时尽量减少目标效果。
我们描述了一种简单有效的协议, 用于在C. 线虫中引入特定于站点的基因组变化。该协议包括目标 sgRNA 和单链寡核苷酸 (ssODN) HDR 模板设计, sgRNA-Cas9 RNP 络合和交付, 以及一个基因分型策略, 以明确识别正确编辑的动物。使用此策略, 不仅可以恢复所需的站点特定更改, 而且还可以恢复其他非特定的 indel 突变。因此, 我们的策略允许使用单一的策略生成一个二等位序列, 在这个方法中, 可以在 F1生成中生成单位、双位和 indel 突变体。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9 系统是精确修改模型生物体基因组的有力而有效的工具。在这里, 我们演示了嵌合体 sgRNAs20与 ssODN HDR 模板结合在一起, 使得在C. 线虫中高效地生成基因组点突变。重要的是, 我们表明, RNP 交付产生高编辑效率时, 荧光作为一个联合选择标记, 突出的易用性和可靠性的技术。
C. 线虫基因组工程的大多数 CRISPR-Cas9 方法都依赖于特定的遗传背?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有与本报告有关的利益冲突。
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
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