迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア リング方法を提示します。
Abstract
クラスター化された定期的に散在させていて回文繰り返し (CRISPR) – CRISPR – に関連したタンパク質 9 (Cas9) 原核生物の適応免疫の防衛システムが抱き込まれてしまった正確な真核生物ゲノム工学のための強力なツールとして線虫のゲノムの点変異の効率的で正確な世代キメラ シングル ガイド Rna (sgRNA) と CRISPR Cas9 Ribonucleoproteins (結合) を使用して迅速かつ簡単な方法を紹介します。SgRNA ターゲットの選択、ホモロジー監督修復 (HDR) テンプレート デザイン、CRISPR Cas9 RNP 錯化と配信、および正しく編集した動物の堅牢かつ迅速な同定を可能にする遺伝子型戦略のパイプラインについて述べる。我々 のアプローチは、変異動物安易な世代とゲノムの任意の場所の同定が可能だけでなく、高効率および減らされたスクリーニング作業負荷で約 4-5 日で他の複雑な塩基の対立遺伝子の検出を容易にも。
Introduction
最近の技術の進歩が根本的に形質転換し、正確にエンジニアのゲノムに能力を加速します。特に、RNA 誘導エンドヌクレアーゼの興味のターゲット シーケンスに近い二重鎖切断 (DSB) を誘導する Cas9 に頼る、CRISPR Cas9 システムは広くモデル有機体の使用の大半のゲノムを正確にエンジニアに使用されています生物医学研究1,2,3,4。大幅に CRISPR Cas9 の使用は、ゲノムはc. の elegans5のような困難な種でも編集ロックを解除が。種に関係なく編集システム基づく CRISPR Cas9 ゲノムと点突然変異を生成する 3 つのコア コンポーネントに依存しています: 1) Cas9 エンドヌクレアーゼ、ターゲット シーケンスと 3) 設計ユーザーに Cas9 エンドヌクレアーゼを指示する 2) シングル ガイド RNA (sgRNA)2興味の目的の編集を含むホモロジー監督修理 (HDR) テンプレートです。
ターゲットの sgRNA と Cas9 を紹介するために使用できるいくつかの方法があるプラスミッド、RNA ウイルス ベースの配信方法6などのセルにヌクレアーゼ。最近、中古複合 sgRNA Cas9 Ribonucleoproteins (結合) の直接配信は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム編集7で強力で効率的なツールとして浮上しています。中古複合 CRISPR Cas9 結合の直接配信はいくつかのメリット、すなわち: 1) 結合細胞のトランスクリプションのための必要性のバイパス、翻訳、2) 結合が急速にクリアされ、特異性を増加するには可能性があります利用可能な時間の短縮オフ ターゲット胸の谷間、そして 3) 結合に非ネイティブのシーケンスをランダムな統合により宿主ゲノムに導入を回避する外国の DNA ・ RNA 要素が含まれていません。一緒に、これらの属性の可能性が高いターゲットに CRISPR 編集オフターゲット効果を最小限に抑えながらの短いバーストを提供します。
線虫 c. エレガンスのサイト固有の genomic 変更を導入するための簡単かつ効率的なプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、ターゲットに正しく編集した動物を明確に同定のジェノタイピング戦略と配信、sgRNA Cas9 RNP 錯単一鎖オリゴヌクレオチド (ssODN) HDR テンプレート デザイン sgRNA 含まれています。この戦略を使用すると、目的のサイト固有の変更を回復できる、だけでなく他の非特定塩基の変異を回復も可能性があります。したがって、当社の戦略は、1 つの戦略を使用してモノラル対立、bi 対立、対立シリーズの生成を許可、F1世代で塩基変異を生成できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR Cas9 システムのモデル生物のゲノムを正確に変更するための強力かつ効果的なツールです。ここでは、そのキメラ sgRNAs20と相まって ssODN HDR 有効テンプレートに線虫の遺伝子の点変異の高効率生成を示します。重要なは、示す共同選択マーカーとして使用する蛍光 RNP 配信が編集効率を生成する使いやすさと手法の信頼性を強調.
線虫ゲ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このレポートに関連する利害の関係はありません。
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
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