Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.
Abstract
De geclusterde regelmatig afgewisseld palindromische herhaalt (CRISPR) – CRISPR – geassocieerde proteïne 9 (Cas9) prokaryote adaptieve immuunsysteem verdedigingssysteem is gecoöpteerd als een krachtig hulpmiddel voor precieze eukaryotische genoom engineering. Hier presenteren we een snelle en eenvoudige methode met behulp van chimeer één gids RNAs (sgRNA) en CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) voor de efficiënte en nauwkeurige generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. We beschrijven een pijpleiding voor sgRNA-doelverschuiving sjabloonontwerp homologie geleide reparatie (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie waarmee de robuuste en snelle identificatie van correct bewerkte dieren. Onze aanpak niet alleen toelaat de facile generatie en de identificatie van de gewenste genomic punt mutant dieren, maar ook vergemakkelijkt de opsporing van andere complexe indel allelen in ongeveer 4-5 dagen met hoog rendement en een verminderde screening werklast.
Introduction
Recente technologische vooruitgang hebben radicaal getransformeerd en versnelde de mogelijkheid om precies ingenieur genomen. Met name is de CRISPR-Cas9-systeem, dat gebaseerd op de endonuclease van RNA-geleide Cas9 is voor het opwekken van een dubbele streng pauze (DSB) in de buurt van de opeenvolging van de doelgroep van belang, uitgebreid gebruikt voor het nauwkeurig ingenieur het genoom van de meerderheid van de modelorganismen gebruikt in biomedisch onderzoek1,2,3,4. Aanzienlijk, heeft het gebruik van CRISPR-Cas9 ontgrendeld genoom bewerken zelfs in moeilijke soorten zoals C. elegans5. Ongeacht soort, genereren van puntmutaties met het genoom van de CRISPR-Cas9 gebaseerd editing systeem berust op drie componenten van de kern: 1) Cas9 endonuclease, 2) een enkele gids-RNA (sgRNA) die de endonuclease van de Cas9 aan een reeks van doel, en 3) een gebruiker ontworpen leidt homologie geleide reparatie (HDR)-sjabloon met de gewenste edit(s) van belang2.
Er zijn verschillende methoden die kunnen worden gebruikt om de targeting sgRNA en Cas9 in cellen, met inbegrip van de plasmide, RNA en virale gebaseerde levering methoden6nuclease. Onlangs, directe levering van pre-complexvorm sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) heeft ontpopt als een krachtig en efficiënt hulpmiddel in CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom7bewerken. De directe levering van pre-complexvorm CRISPR-Cas9 RNPs heeft verschillende duidelijke voordelen, namelijk: 1) RNPs omzeilen de noodzaak voor cellulaire transcriptie en vertaling, 2) RNPs zijn snel gewist, specificiteit kunnen verhogen door vermindering van de beschikbare tijd voor af-target decolleté, en 3) RNPs bevatten geen buitenlandse DNA/RNA-elementen die de introductie van uitheemse sequenties in het genoom van de host door middel van willekeurige integratie omzeilt. Samen bieden deze kenmerken waarschijnlijk een kortstondige uitbarsting van aan-target CRISPR bewerken terwijl het minimaliseren van uit-target effecten.
Beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de invoering van site-specific genomic veranderingen in C. elegans. Dit protocol omvat gericht op sgRNA en één gestrande oligonucleotide (ssODN) HDR sjabloonontwerp, sgRNA-Cas9 RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie voor de ondubbelzinnige identificatie van goed bewerkte dieren. Met behulp van deze strategie, niet alleen kunnen de gewenste specifieke wijzigingen worden hersteld, maar andere niet-specifieke indel mutaties kunnen ook worden teruggevorderd. Dus onze strategie toelaat de generatie van een allèlique reeks met behulp van één enkele strategie, waar zowel mono-allèlique, bi-allèlique en indel mutanten kunnen worden gegenereerd op de F1 generatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het CRISPR-Cas9-systeem is een krachtige en effectieve tool om het genoom van modelorganismen juist te wijzigen. Hier, we laten zien dat chimeer sgRNAs20 in combinatie met ssODN HDR sjablonen inschakelen de hoogefficiënte generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. Nog belangrijker is, we laten zien dat RNP levering bewerken hoogrenderende produceert wanneer fluorescentie wordt gebruikt als een marker co selectie, markeren het gemak en de betrouwbaarheid van de techniek.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Er zijn geen conflicten van belang in verband met dit verslag.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. 유전학. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
