Tredimensjonale Organotypic kulturer av Vestibular og auditiv Sanseorganer
Summary
Tredimensjonale organotypic kulturer murine utricle og sneglehuset i optisk fjerner kollagen jeg gels bevare medfødte vev morfologi, tillater mekanisk stimulering gjennom justering av matrix stivhet, og tillater virus-mediert gen levering.
Abstract
Sensoriske organer i det indre øret er utfordrende for å studere i pattedyr på grunn av utilgjengelighet deres eksperimentelle manipulasjon og optisk observasjon. Videre, selv om eksisterende kultur teknikker tillater biokjemiske forstyrrelser, gir ikke disse metodene å studere virkningene av mekanisk kraft og vev stivhet under utviklingen av indre øret sensoriske organer. Her beskriver vi en metode for tredimensjonale organotypic kultur intakt murine utricle og sneglehuset som overvinner disse begrensningene. Teknikken for justering av en tredimensjonal matrix stivhet beskrevet her tillater manipulering av elastisk force motsatte vevvekst. Denne metoden kan derfor brukes til å studere rollen til mekaniske krefter under utviklingen av indre øret. I tillegg tillater kulturer virus-mediert gen levering, som kan brukes for gevinst og tap-av-funksjon eksperimenter. Denne kultur metoden bevarer medfødte hårcellene og støtte celler og fungerer som et potensielt bedre alternativ til tradisjonelle todimensjonal kultur vestibular og auditiv Sanseorganer.
Introduction
Studiet av de fleste aspekter av pattedyr orgel utvikling har blitt lettere ved in vitro -systemer. To viktigste metoder blir brukt til kultur vestibular Sanseorganer: frittflytende1 og tilhenger2 forberedelser. Begge metodene tillater etterforskningen av hår celle sikkerhetsproblemer3 og regeneration1,4 i vitro. I tillegg har utviklingsmessige rollene hakk5,6, Wnt7,8og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)9,10 signalering kaskader i det indre øret opprettet en delvis gjennom bruk av i vitro kulturer av sensoriske epithelia. Imidlertid cellevekst og differensiering kontrolleres, ikke bare gjennom signalering av morphogens, men også gjennom fysisk og mekanisk signaler som intercellulære kontakter, stivhet av ekstracellulær matrix, og mekanisk strekkes eller innsnevring. Rollen av slike mekaniske stimuli er utfordrende å undersøke i utvikle indre øret i vivo. Videre er eksisterende frittflytende og tilhenger kultur metoder ikke egnet for slike studier i vitro. Her vi beskriver en metode for tredimensjonale organotypic kultur i kollagen jeg gels av varierende stivhet. Denne metoden hovedsakelig bevarer arkitektur i vivo vestibular og cochlear sensoriske organer og tillater undersøkelse av effekten av mekanisk kraft på vekst og differensiering11.
Fordi mekanisk stimuli er kjent for å aktivere nedstrøms molekylære hendelsene Hippo signalering veien12,13,14,15, er det viktig å kunne kombinere mekanisk stimulering med biokjemiske og genetiske manipulasjoner. Kultur metoden beskrevet her tillater virus-mediert gen levering og kan derfor brukes til å studere både mekanisk og molekylære signalering under indre øret utvikling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molekylær signaler som megle vekst og differensiering i det indre øret under utvikling har vært studert5,,6,,7,,8,,9,,10. Bevis fra utricular modell systemet antyder imidlertid at mekanisk signaler, følt gjennom cellen veikryss og aktivering av Hippo signalnettverk, også spille en viktig rolle i disse prosessene<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi og A. Petelski for deres bidrag til den opprinnelige forskningen som er basert på denne protokollen. Vi takker også J. lamaer og W. Makmura for kundestøtte og husdyrhold. Vi erkjenner NIDCD trening grant T32 DC009975, NIDCD gi R01DC015530 Robertson terapeutiske Development Fund og Caruso familien grunnlaget for finansiering. Til slutt, vi erkjenner støtte fra Howard Hughes Medical Institute, som Dr. Hudspeth er en etterforsker.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
