Tredimensionella Organotypic kulturer av vestibulära och auditiv sinnesorgan
Summary
Tredimensionella organotypic kulturer av murina utricle och snäckan i optiskt klart kollagen jag geler bevara medfödda vävnad morfologi, möjliggöra mekanisk stimulering genom justering av matrix stelhet och tillåta virus-medierad gen leverans.
Abstract
De sensoriska organen i innerörat är utmanande för att studera hos däggdjur deras otillgänglighet till experimentella manipulation och optisk observation. Dessutom även om befintliga kultur tekniker tillåter biokemiska störningar, ger dessa metoder inte ett sätt att studera effekterna av mekanisk kraft och vävnad stelhet under utvecklingen av innerörat sensoriska organ. Här beskriver vi en metod för tredimensionella organotypic kultur intakt murina utricle och snäckan som övervinner dessa begränsningar. Tekniken för justering av en tredimensionell matris stelhet beskrivs här tillåter manipulering av elastisk kraft motsatta vävnadstillväxt. Denna metod kan därför användas för att studera rollen av mekaniska krafter under innerörat utveckling. Dessutom, ger kulturerna virus-medierad gen leverans, som kan användas för vinst – och förlust-av-funktion experiment. Denna kultur metod bevarar medfödda hårcellerna och stöder celler och fungerar som ett potentiellt överlägset alternativ till den traditionella tvådimensionella kulturen av vestibulära och auditiv sinnesorgan.
Introduction
Studien av de flesta aspekter av däggdjur orgel utveckling har underlättats av in vitro- system. Två huvudsakliga metoder används nu för kulturen i vestibulära sensoriska organ: fritt flytande1 och vidhäftande2 preparat. Båda metoderna tillåta utredning av hår cell sårbarheter3 och förnyelse1,4 in vitro. De utvecklingsmässiga rollerna av Notch5,6, Wnt7,8, och epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades i innerörat har dessutom fastställts, delvis med hjälp av in vitro- kulturer av sensorisk epitel. Dock är celltillväxt och differentiering kontrollerade, inte bara genom signalering av morphogens, men också genom fysiska och mekaniska signaler såsom intercellulära kontakter, styvheten hos extracellulärmatrix, och mekanisk stretching eller sammandragning. Rollen av sådana mekaniska stimuli är utmanande att undersöka i utvecklingsländer innerörat i vivo. Dessutom passar befintliga friflytande och vidhäftande kultur metoder inte sådana studier in vitro. Här beskriver vi en metod för tredimensionella organotypic kultur i kollagen geler jag varierande styvhet. Denna metod till stor del bevarar i vivo arkitekturen av de vestibulära och cochlear sinnesorgan och tillåter undersökning av effekterna av mekanisk kraft på tillväxt och differentiering11.
Eftersom mekaniska stimuli är känd för att aktivera nedströms molekylära händelser, såsom flodhästen signalering utbildningsavsnitt12,13,14,15, är det viktigt att kunna kombinera mekanisk stimulering med biokemiska och genetiska manipulationer. Metoden kultur beskrivs här tillåter virus-medierad gen leverans och kan därför användas för att studera både mekanisk och molekylär signalering under innerörat utveckling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De molekylära signaler som medla tillväxt och differentiering i innerörat under utveckling har studerats ingående5,6,7,8,9,10. Bevisning som erhållits från utricular modell systemet tyder dock på att mekaniska ledtrådar, kände igenom cellen korsningar och aktivering av Hippo signalering, också spela en viktig roll i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi och A. Petelski för deras bidrag till den ursprungliga forskningen som detta protokoll baseras. Vi tackar också J. lamor och W. Makmura för tekniskt bistånd och djurhållning. Vi erkänner NIDCD utbildning grant T32 DC009975, NIDCD bevilja R01DC015530, Robertson terapeutiska utvecklingsfonden och stiftelsen Caruso familj för finansiering. Slutligen, vi erkänner stöd från Howard Hughes Medical Institute, som Dr Hudspeth är en utredare.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
