Summary
وسيمكن هذا البروتوكول للقراء بنجاح إنشاء نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق وبعد ذلك عزل والثقافة المعوية الخلايا الجذعية لدراسة إصلاح الظهارية بعد إصابة.
Abstract
ويظل الاسكيمية المعوية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في المرضى البشرية والبيطرية. تؤدي العديد من الأمراض العمليات في الاسكيمية المعوية، عندما انخفضت إمدادات الدم، وبالتالي الأكسجين للامعاء. هذا يؤدي إلى فقدان جدار الأمعاء والأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. تتواجد في قاعدة الخبايا Lieberkühn الخلايا الجذعية المعوية وهي المسؤولة عن تجديد المعوية خلال التوازن والإصابات التالية. وأتاحت دراسة التفاعلات بين الخلايا الجذعية الظهارية ناجحة السابقين فيفو تقنيات استزراع خلية بوضع شروط الثقافة التي تدعم نمو النظم مثل جهاز الظهارية ثلاثي الأبعاد (يسمى "انتيرويدس" و " كولونويدس "من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي). هذه انتيرويدس مكونة من سرداب ومجالات مثل زغابة وناضجة لاحتواء كافة أنواع الخلايا وجدت داخل الظهارة. تاريخيا، استخدمت نماذج مورين لدراسة الإصابة المعوية. ومع ذلك، يقدم نموذجا الخنزير العديد من المزايا بما في ذلك تشابه الحجم فضلا عن تشريح الجهاز الهضمي وعلم وظائف الأعضاء للبشر. باستخدام نموذج الخنزير، يمكننا وضع بروتوكول التي قطعي حلقات من الأمعاء الاسكيمية يمكن أن تنشأ داخل حيوان مفردة، وتمكن الدراسة من اختلاف الوقت النقاط من الإصابات الدماغية وإصلاح فيفو. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف طريقة لعزل والثقافة أن الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية من الأمعاء، مما يسمح لمواصلة دراسة إصلاح الظهارية، عن طريق الخلايا الجذعية، والتضمين السابقين فيفو.
Introduction
الإصابات الدماغية المعوية، ونتيجة لتوافر الأوكسجين انخفض بسبب تخفيض أو انسداد كامل لتدفق الدم إلى الأمعاء، ما زالت سببا هاما للمراضة والوفيات في المرضى الإنسان والحيوان1،2. الأضرار الدماغية، جنبا إلى جنب مع التهاب لاحقة وتسلل الخلوية، يؤدي إلى حل وسط الحاجز المخاطي. أن الحاجز المخاطي أمر حاسم لمنع إزفاء البكتيرية والسموم المرتبطة بها إلى الدوران الجهازي3،4. يمكن أن يؤدي تشكيل إلحاق الضرر بالأنواع الأكسجين التفاعلية التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم إصابة5ضخه اللاحقة من الأنسجة الدماغية. منذ الاسكيمية المعوية نادراً ما يمكن الوقاية منها، معظم الأبحاث الحالية تركز على النهوض بتقنيات الكشف المبكر عن الاسكيمية وتطوير رواية النهج العلاجية التي تقلل من ضخه الإصابة أو هدف إصلاح الغشاء المخاطي.
نماذج حيوانية قد استخدمت على نطاق واسع لتوسيع معرفتنا العلوم الأساسية من الإصابة ضخه الاسكيمية، وتظل الحتمية للبحوث متعدية الجنسيات. وكانت نماذج القوارض الأكثر استخداماً نظراً لقدرتها على أن تكون محوره وراثيا6. في الآونة الأخيرة بيد استخدام نماذج حيوانية كبيرة، على وجه التحديد الخنزير، قد دعت للدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل نظراً لوجود عدد من المزايا بما في ذلك أوجه التشابه الخنازير التشريحية والفسيولوجية للبشر7،8. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الضرر لدراسة الإصابة الاسكيمية-ضخه وتشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، الاسكيمية التدفق المنخفض وانسداد الأوعية الدموية المساريقي العلوي القطاعي. استعراضاً كاملا لهذه النماذج هو خارج نطاق هذه المقالة المباشر الكتاب القراء إلى مراجعة الأخيرة3.
ويتيح الاستخدام السابقين فيفو نظم الثقافة الخلوية بالإضافة إلى نماذج في فيفو ، أداة واعدة لدراسة التوازن المعوية وإصلاح بعد الإصابة. الأمعاء والخلايا الجذعية المسؤولة عن انتشار الهاتف الخلوي ودوران البطانة الظهارية المعوية. عندما معزولة من الأمعاء العادية أو الجرحى، الخلايا الجذعية المعوية يمكن الحفاظ على الثقافة، وتخدم كأداة أو نموذج لدراسة الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا الظهارية. طرق عزل وإقامة هذه ثلاثية الأبعاد الثقافة نظم (يطلق عليها انتيرويدس وكولونويدس عند المستمدة من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي) وقد وصف لمجموعة متنوعة من الجهاز وأنواع نظم9،10 11، ،،من1213. على وجه التحديد، داخل الجهاز الهضمي، استخدمت هذه النظم الثقافة إلى أمراض معوية نموذجية بما في ذلك السرطان والإصابة بمسببات الأمراض و مرض التهاب الأمعاء14. وفي هذا الوقت، لا توجد تقارير تصف بالعزلة والحفاظ على الخلايا الجذعية المعوية من إيشيميكالي إصابة الأمعاء الدقيقة في أي من الأنواع. ولذلك، نحن هنا وصف عملية الاسكيمية المعوية في الرواية كبير حيوان الخنزير نموذج، مما يسفر عن إصابة استنساخه والقدرة على عزل الخلايا الجذعية المعوية من الأمعاء العادية والمصابين إيشيميكالي لدراسة إضافية استرداد السابقين فيفو.
Protocol
لهذه التجارب، وقد أقر جميع الدراسات الحيوانية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية كارولينا الشمالية.
1-التحضير للثقافة
ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف في الجدول للمواد. تركيزات عامل النمو محددة مدرجة في الجدول 1.
- إعداد حل حمض (يدتا) الإيثيلين 0.5 متر في المياه المقطرة (ddH2س). مزيج كاف وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام محاليل هيدروكسيد الصوديوم و/أو HCl.
ملاحظة: تشكل الحل الأسهم يدتا جديدة قبل كل تجربة. - إعداد كاشف تفارق #1 (الدكتور #1) على النحو التالي ووضع على الجليد: الفوسفات الجمع مخزنة المالحة دون Ca2 + و Mg2 + (PBS)، 0.5 م يدتا، 1 م 1، 4-ديثيوثريتول (DTT)، 10 ميكرون Y27632 والحل س مضاد حيوي فطري 1 (مكافحة المضادة) تتضمن البنسلين والستربتوميسين والامفوتريسين باء
ملاحظة: إضافة Y27632 قبل جمع الأنسجة مباشرة. - إعداد كاشف تفارق #2 (الدكتور #2) على النحو التالي ووضع في حمام مائي 37 درجة مئوية: "الجمع بين برنامج تلفزيوني" دون Ca2 + و Mg2 +، يدتا 0.5 متر، 10 ميكرون Y27632 والمضادة لمكافحة س 1. ملاحظة: إضافة Y27632 قبل جمع الأنسجة مباشرة.
- تعد الخلايا الجذعية الظهارية المعوية (إيسك) وسائط الإعلام على النحو التالي: ميكس 25 مل متقدمة متوسطة DMEM/F12 مع الملحق X N2 1، الملحق 1 X B-27، 10 مم حبيس، 2 مم جلوتاماكس والمضادة لمكافحة س 1. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد مزيج رئيسي لانخفاض النمو عامل الغشاء مصفوفة (مصفوفة) وعوامل النمو الإضافي كما يلي: ذوبان الجليد المصفوفة على الجليد. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، إضافة 100 نانوغرام/مليلتر رأس الإنسان المؤتلف، 500 نانوغرام/مليلتر المؤتلف 1 R-سبوندين البشرية، 50 نانوغرام/مل الماشوب البشري البشرة عامل النمو (لو)، 100 نانوغرام/مل Wnt3a البشري المؤتلف، 10 مم نيكوتيناميد، 10 نانومتر جاسترين، 500 نانومتر A-83-01، 10 ميكرون Y-27632 ، 10 مم SB202190، 500 نانومتر LY2157299 و 2.5 ميكرون الجليكوجين synthase كيناز 3 المانع (GSK3i، CHIR99021). عندما يتم إذابة المصفوفة، مع استكمال هذا المزيج عامل النمو (صنع مزيج الرئيسي) وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: كن حذراً لتجنب إدخال فقاعات الهواء كما سيؤدي هذا إلى إنشاء قطعة أثرية داخل باتي مصفوفة أثناء الطلاء. - قبل الحارة طبق استنبات الأنسجة 24-جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية قبل البدء بإجراءات عزل الخلية.
2-الجراحي النموذجي الاسكيمية، وجمع الأنسجة
- نيوزيلند استخدام ثمانية إلى يوركشاير عمرها عشر الأسبوع الخنازير من أي من الجنسين (مستحسن). قم بإزالة جميع الأعلاف ح 16-18 قبل الجراحة. تسمح الخنازير للحصول على المياه في جميع الأوقات.
- جدولة الخنازير يصل إلى مالا يقل عن 48 ساعة قبل التجارب للسماح للتأقلم البيئي.
ملاحظة: توفير فنيين مدربين في الطب البيطري و/أو المختبر تحت إشراف طبيب بيطري مرخص الرعاية الحيوانية الروتينية والمساعدة مع إجراءات مخدر. - بريميديكاتي الخنزير مع إكسيلازيني (1.5 مغ/كغ عضليا (IM)) والكيتامين (11-20 مغ/كغ (IM))15. وبمجرد وقور، التنبيب أوروتراتشيلي خنزير.
- الحفاظ على الخنازير تحت التخدير العام مع إيسوفلوراني (2-5%) ويتبخر في 100% O2 حتى وقت القتل الرحيم.
- ضع قسطرة (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي (الوريد الإذن الموصى بها) وإدارة سوائل استبدال مثل الحل قارعو الأجراس لاكتاتيد صيانة بمعدل 15 مل/كغ/ساعة.
- إجراء روتيني مخدر الرصد بما في ذلك pulse oximetry وكهربيه و قياسات ضغط الدم غير المباشرة15. رصد معدل التنفس للخنزير والجهد ويحققوا يدوياً أو آليا حسب الحاجة إذا كان نهاية المد CO2 ترتفع إلى 55-60 مم زئبق.
ملاحظة: التخدير المناسبة ويتأكد من الرصد المستمر للاتجاهات في معدل ضربات القلب (مجموعة 80-130 نبضة/دقيقة)، وضغط الدم غير الغازية (يعني الضغط الشرياني 75-100 مم زئبق)، ومعدل التنفس (10-25 نفسا/دقيقة)16، والتدقيق الدوري لعدم وجود فكه ولهجة الشرج. يمكن أيضا الحكم على عمق التخدير بدرجة استرخاء العضلات وتليف العضلات بعد التحفيز الجراحية. عادة ما تكون ردود الفعل العين من لا قيمة16. ويمكن توفير التسكين حسب توجيهات السياسة IACUC المؤسسات. وفي هذه الحالة، يمكن أن تدار شبائه الأفيون، مثل البوبرينورفين، أثناء الجراحة. - مكان في الخنزير على وسادة تدفئة وكبح جماح في ريكومبينسي الظهرية للعملية الجراحية.
- يحلق في البطن البطني والإعدادية باستخدام فرك الجراحية (محلول الكلورهيكسيدين) وكحول الأيزوبروبيل.
- جعل شق 8-10-سم البطني خط الوسط باستخدام شفرة المبضع تركزت في السرة للوصول إلى البطن.
- تحديد الفم الأمعاء (صائم) حوالي 40 سم إلى مفترق اللفائفيه. تحدد سم عشرة حلقات طويلة من صائم قبل circumferentially ligating الأمعاء مرتين، سم واحد بين كل حرف مزدوج، قبل إنشاء لاحقة حلقات 10 سم يقع شفويا (الشكل 1).
- إنشاء اثنين من الحلقات كل نقطة الوقت من الاسكيمية المجاورة لبعضها البعض، وواحدة الاسكيمية، وواحد الاسكيمية مع ح 1 إضافية من ضخه إذا رغبت في ذلك. لإنشاء الاسكيمية كاملة (أي تدفق للشرايين أو الأوردة)، المشبك أو سد المفرج المساريقي العلوي استخدام المشابك لدغ الأوعية الدموية أو منحنية هالستد البعوض هيموستاتس الحرير غير الامتصاص 2-0 ل 1، 2، 3 و 4 ح ومن ثم إزالة المشابك ح 1 من ضخه، إذا رغبت في ذلك.
ملاحظة: الكتاب تم إنشاؤها جميع الحلقات من الاسكيمية بالترتيب بدءاً بحلقة الدماغية ح 4 وتقدم نقل بروكسيمالي (لتقليل وقت جراحة الكلي). للتصدي لإمكانية أن قطاعات الأمعاء الدماغية المجاورة قد تتلف الحلقات المتاخمة، يمكن أن تختلف ترتيب الحلقات الدماغية. وهذا قد يغير إجمالي الوقت الجراحية.
ملاحظة: الإطار الزمني لضخه يمكن أن تختلف استناداً إلى البحوث مسألة الفائدة أو إذا كانت العلاجات ترغب في اختبارها خلال فترة ضخه. بيد تلف الأنسجة يصبح أكثر شدة من زيادة مدد الاسكيمية وحدها، ضخه الضرر المحتمل لا يسهم في زيادة الإصابة الظهارية. ضخه المرجح أن تقوم بدور عقب فترات معتدلة من الإصابات الدماغية. - الفترات الفاصلة بين النقاط الزمنية الاسكيمية، الحفاظ على البطن تغطيتها أو إغلاق باستخدام منشفة عقيمة و/أو المشبك منشفة.
ملاحظة: داخل حيوان وحيد لهذه التجربة، يمكن إنشاء ثمانية قطاعات الدماغية. تحديد جزء jejunal إضافية، على الأقل 5-10 سم الدانية إلى آخر حلقة الدماغية، التي ستكون بمثابة رقابة داخلية عادية. - تعرقل حوالي ثلاث سفن المساريقي العلوي كل لدغ المشبك الأوعية الدموية أو منحنية هالستد البعوض هيموستات. يجب الحرص أثناء تطبيق هيموستات لأن هذه السفن هي صدمة بسهولة. محاولة المكدس بالسفن داخل الفكين المشابك.
- في نهاية هذه التجربة، القتل الرحيم التالية مع بينتوباربيتال الرابع 85-100 مغ/كغ، بجمع جميع الحلقات من الأنسجة باستخدام مقص ميتزينبوم، بعد أن تأكدت وفاة لا ضربات القلب أوسكولتاتيد وفقدان منعكس القرنية. ابدأ بجمع قطعة تحكم صائم العادي على الأقل 5-10 سم الدانية حلقة الدماغية الأخير.
- فصل وتخزين الحلقات من كل نقطة وقت الإصابة في حاويات صغيرة من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني حتى جاهزة لعزل سرداب.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، جعل الدماغية الحلقات طويلة بما يكفي لتقسيم عينات منفصلة لعلم الأنسجة والخلايا الجذعية المعوية الثقافة؛ ومع ذلك، وجدت الكتاب أن الحلقات أكبر من طول 10 سم تقريبا الأكثر احتمالاً أن تصبح النزفية.
3-سرداب (الخلايا الجذعية) في معزل عن الدماغية وحلقات التحكم
- عكس كل حلقة من الأمعاء الدقيقة باستخدام أسلاك 20-قياس وملقط الأنسجة لفضح السطح المخاطي. ربط أعلى وأسفل الحلقة بشكل أمن إلى السلك باستخدام خياطة (2-0 الحرير غير الامتصاص أو ما يعادلها).
- وفي أعقاب الانقلاب، شطف كل حلقة في برنامج تلفزيوني الباردة الجليد لإزالة الحطام لومينال.
- وضع العينات فورا إلى 50 مل أنابيب مخروطية تحتوي على الدكتور #1 على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- جمع الحلقات بدءاً من مراقبة ومتابعة مع الحلقات تدريجيا زيادة مدد الاسكيمية. يمكن اهتزت الحلقات من أقل الأنسجة التالفة (أي عنصر التحكم وح 1 الدماغية الأنسجة) قوة العض المعصم للحصول على أفضل النتائج. ينبغي هز الأنسجة من الأنسجة لحقت بها أضرار بالغة (ح 3 و 4 من الاسكيمية) بلطف أو مقلوب فقط كما تهتز كثيرا سوف يسبب تعطل سرداب وتدمير الأنسجة الإضافية. وينبغي أن اهتزت أنابيب أو مقلوب كل 5 دقائق في حين على الجليد.
- نقل العينات إلى الدكتور #2 لمدة 10 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. اهتزاز أو عكس أنابيب كل 5 دقائق.
- بعد نقل الأنسجة، الطرد المركزي أنابيب مخروطية تحتوي على الدكتور #1 من الحلقات ح 2-4 أضرار لإزالة يدتا طافية (200 غ س لمدة 5 دقائق). كما تتلف هذه الأنسجة بدرجة عالية من الممكن الأقبية قد تصبح نات بالفعل. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني (5 مل) وانتقل إلى الخطوة 3، 9.
- إزالة عينات من الدكتور #2 ووضع عينات الأنسجة مباشرة إلى 25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد (التسمية كغسل #1). وضع العينات على شاكر مداري على الجليد في دورة في الدقيقة 60. ما زالت تهز أو عكس كل أنبوب لمدة 30 ثانية كل دقيقة 2 إلى 5.
- بعد نقل الأنسجة، تدور هذه الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الدكتور #2 من ح 2-4 أضرار الحلقات لإزالة يدتا طافية (200 غ س لمدة 5 دقائق). كما تضررت هذه الأنسجة شديدة فمن الممكن أنه قد أصبح فصل في الأقبية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني (5 مل) وانتقل إلى الخطوة 3، 9.
- إزالة من قاسمة 50 ميليلتر من يغسل #1 (أو من الدكتور) للتحقق من درجة الانفصال من سرداب وكمية من الحطام. وضع الأنسجة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد (أغسل #2، #3، إلخ) مليئة 25 مل الباردة برنامج تلفزيوني ويهز حتى الأقبية سليمة معزولة مع الحد الأدنى من الحطام والزوائد.
ملاحظة: الهدف أن تكون قادرة على عزل جزء نظيف مع الأقبية سليمة والحد الأدنى من الحطام. كل غسل إضافية سوف تنظيف الخلايا تهتز ولكن الكثير سوف تبدأ أن ينجم عنه ضرر ثانوي الأنسجة/خلية. وعلاوة على ذلك، يتحقق أفضل النتائج مع أقل من التلوث إذا هي مطلي الأقبية من خطوة غسيل وليس من خطوة كاشف الانفصال. - إزالة الأنسجة المتبقية والطرد المركزي هذه الأنابيب المخروطية 50 مل في 200 x ز لمدة 5 دقائق لإزالة المادة طافية، ثم ريسوسبيند المتبقية بيليه سرداب في حجم أصغر من برنامج تلفزيوني (5 مل).
- استخدام مجهر مقلوب، فحص 50 ميليلتر مختبرين لكل عينة لتحديد عدد من الأقبية/الكسر. والهدف هو 50-100 ميليلتر الخبايا/50، كما سيكون هذا حجم أتى المصفوفة النهائي.
ملاحظة: إذا كانت العينة مركزة جداً، استمر في إضافة برنامج تلفزيوني الباردة حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب. إذا كان نموذج مخفف جداً، تحديد عدد مختبرين اللازمة للوصول إلى سرداب المطلوب الغلة وضبط. - الكوة وحدات مناسبة للأقبية (يحدده الملاحظات الكوة) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. على سبيل المثال، إذا كان نموذج يحتوي على 50 الأقبية/50 ميليلتر ثم ميليلتر 50 الكوة الواحدة باتي يتطابق X 3 = 150 ميليلتر/أنبوب ميكروسينتريفوجي. إذا كان النموذج يحتوي فقط على 25 الأقبية/50 ميليلتر ثم 2 مختبرين الحاجة/يتطابق باتي X 3 = 300 ميليلتر/الأنبوبة.
- بيليه الأقبية في 200 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند برفق الأقبية الأعلاف مع حجم المناسبة من مزيج الرئيسي (50 ميليلتر للبئر الواحد). مزيج دقيق بسرعة بيبيتينج 15 مرة دون خلق فقاعات الهواء.
ملاحظة: قبل بارد نصيحة ماصة مع PBS العقيمة الباردة قبل يسفط مزيج الرئيسي. وهذا سيساعد على الحفاظ مزيج الرئيسي من يتباعد. نصائح يمكن أيضا الاحتفاظ في الثلاجة ووضعها في غطاء محرك السيارة فورا قبل استخدامها. - الاستغناء عن 50 ميليلتر ميكس الرئيسية بالإضافة إلى سرداب الحبرية إلى مركز لكل بئر من صفيحة جيدا 24 المعالجون مسبقاً.
- احتضان لوحة الثقافة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تراكب كل أتى مصفوفة مع 500 ميليلتر/جيدا من إيسك الوسائط (لا نمو العوامل الإضافية اللازمة في اليوم 0 كما هي واردة ضمن مزيج الرئيسي).
- إضافة 500 ميليلتر PBS العقيمة إلى الآبار غير المستعملة أي اليسار في لوحة للحفاظ على رطوبة.
- عد عدد من الأقبية مطلي في اليوم 0.
ملاحظة: أنها مفيدة للشبكة قبل كل خلية ثقافة لوحة في الأرباع للمساعدة على ضمان العد أكثر دقة. - عد عدد من انتيروسفيريس كل 24 ساعة، ورصد للتنمية انتيرويد يوميا.
- إضافة عوامل النمو لكل حاء 48 جيدا كل إزالة الوسائط إيسك كل ح 96 واستبدال مع 500 ميليلتر وسائط جديدة (عوامل النمو يجب ثم إضافة إلى وسائل الإعلام).
Representative Results
تم إنشاؤه الاسكيمية المعوية كاملة في حلقات الأمعاء الصغيرة عن طريق استخدام انسداد الأوعية الدموية مع خياطة أو المشابك كما هو مبين في الشكل 1. عن طريق الإفراج عن المشابك، يمكن أن يؤديها فترة ضخه الخاضعة لمراقبة، مما يسمح لدراسة إضافية للإصابة ضخه اللاحقة إذا رغبت في ذلك. ونجا جميع الحيوانات أثناء الإجراء مع الحد الأدنى من المضاعفات حتى القتل الرحيم. المضاعفات الجراحية الأكثر شيوعاً هو انخفاض ضغط الدم، التي تحل مع مكملات من المقوى إيجابية مثل الدوبوتامين.
إذا أجرى بشكل صحيح، سوف تبدأ في غيض الزوائد المعوية الإصابات الدماغية وتهاجر إلى أسفل داخل السرداب كفترة زيادات الاسكيمية (الشكل 2). يمكن أن يحدث خطأ مشترك واحد مع تقنية جراحية عندما الأوعية الدموية غير متصلة أو فرضت بالتساوي. والنتيجة هي الاسكيمية نزفية (الشكل 3)، الذي ينهار على المنوال رقيقة الجدران قبل الشريان، مما يسمح للدم الإضافية اختراق الأنسجة. ويعتبر هذا صارخ على سطح سيرسال أرجواني داكن (الرقم 3من اليسار) بالمقارنة مع سطح اشحب خلال كامل الاسكيمية (الشكل 3، حق).
وبعد إزالة الحلقات المعوية الدماغية، الخبايا المعوية كانت معزولة بنجاح عقب الانفصال من البروتوكول (الشكل 4). كما هو متوقع، كثيرا ما كانت أقبية من تيميبوينتس التالفة أكثر شدة مكسورة (و؛ بلغة) ويرد الكسور القبو أكثر الحطام الخلوية في الخلفية عند مقارنتها بتلك التي خضعت للا أضرار خفيفة. خلال البروتوكول، يجب أن تهتز الأمعاء إصابة شديدة برفق لتجنب المزيد من الضرر للأنسجة الكامنة. هز جداً تقريبا يمكن أن يؤدي المزيد من سرداب الأضرار والغالبية من أقبية ينتهي بهم المطاف في الحلول الدكتور المحتوية على يدتا، أسفر عن تعطل إضافية.
وبمجرد مطلي، الأقبية من جميع النقاط الزمنية من الاسكيمية البقاء على قيد الحياة وقادرون على ترسخ في الثقافة (الشكل 5). عندما يتم مطلي الخبايا المعوية العادية وتلف أقل ما يقال في الثقافة، ونموذج انتيروسفيريس داخل ح 24-48. مع أضرار الدماغية (ح 3 و 4)، الخبايا المعوية البقاء على قيد الحياة، لكن معطوبة، أسفر عن تشكيل المجالات أصغر بكثير في البداية. من ح 72-120، انتيرويدس أصبحت أكثر تعقيداً مع لومن مركزية واضحة وهياكل مهدها. وعموما، هناك من كفاءة نمو انخفض من أقبية، فضلا عن انخفاض حجم انتيرويدس المستمدة من الأنسجة المعوية لحقت بها أضرار بالغة (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
الشكل 1 : نموذج الجراحية من الاسكيمية المعوية كاملة في نموذج خنزيري. A) الطبيعي صائم الخنزير اكستيريوريزيد. ب) وقد كانت متصلة سفن المساريقي العلوي مع خياطة خلق الاسكيمية المعوية. ج) الاسكيمية التي تم إنشاؤها باستخدام المشابك لدغ الأوعية الدموية للسماح للأنسجة ضخه إذا رغبت في ذلك. د) المعوية المفرج فور إزالة المشابك الأوعية الدموية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الأدلة النسجية (الهيماتوكسيلين وويوزين وصمة (H & E)) لزيادة الأضرار الظهارية بعد فترات أطول من الاسكيمية المعوية كاملة- يبدأ الضرر في غيض الزوائد مع فقدان تدريجي طبقة طلائي خلية مفردة، وأحبطت زغابة والأضرار الخلوية توسيع وصولاً إلى سرداب قاعدة مع إصابة شديدة (لمدة تصل إلى 4 ح). شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الأدلة الإجمالية ونسيجية من الاسكيمية النزفية. A) الصورة الإجمالي مقارنة الاسكيمية النزفية (حلقة الأيسر) وكامل الاسكيمية (حلقة الحق). عند المفرج غير متصلة أو فرضت بالتساوي، الدم يمكن الاستمرار في التسلل الأنسجة، مما يؤدي إلى التهاب إضافية والضرر. ب) صور الاسكيمية النزفية من زيادة المدة من 1-4 ح ح & ه. بالإضافة إلى الأضرار الخلوية ينظر مع الاسكيمية كاملة، هناك دليل على تسلل خلايا الدم الحمراء داخل بروبريا الصفيحة المحيطة بها. شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : مختبرين الخبايا المعوية المعزولة من حلقات الأمعاء الدماغية وعادي. الخبايا المعوية كاملة وسليمة (علامات نجمية) كانت معزولة بنجاح من كل حلقة من الأمعاء. كما هو متوقع، الأقبية من أكثر النقاط الزمنية لحقت بها أضرار بالغة كثيرا ما تكون مقطوعة (و؛ يفتت) ويرد الكسور القبو أكثر الحطام الخلوية في الخلفية عند مقارنتها بتلك التي خضعت للا أضرار خفيفة. شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : دورة الوقت لنمو الخلايا الجذعية المعوية بعد عزلة من الحلقات الدماغية من الأمعاء. عندما كانت مطلي الخبايا المعوية العادية في الثقافة، شكلت انتيروسفيريس داخل ح 24-48. مع أضرار الدماغية (ح 3 و 4)، الأقبية البقاء على قيد الحياة، لكن تشكل مجالات أصغر بكثير في البداية. من ح 72-120، انتيرويدس أصبحت أكثر تعقيداً مع لومن مركزية واضحة وهياكل مهدها. 20 ميكرون حجم شريط ما سجلته. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| عامل النمو | مخفف | تركز الأسهم | تمييع الأسهم | تمييع العمل |
| R-سبوندين | برنامج تلفزيوني | 100 X | 100 ميكروغرام/مل | 1 ميكروغرام/مل |
| رأس | SW/0.1%BSA | 1000 X | 100 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مليلتر |
| لو | 10 ملم حمض الخليك | 10,000 X | 500 ميكروغرام/مل | 50 نانوغرام/مليلتر |
| ألف-83-01 | [دمس] | 1000 X | 500 ميكرومتر | 500 نانومتر |
| SB202190 | [دمس] | 3000 X | 30 مم | 10 ميكرومتر |
| نيكوتيناميد | SW | 1000 X | م 1 | 1 مم |
| جاسترين | برنامج تلفزيوني | 10,000 X | 100 ميكرومتر | 10 نانومتر |
| Y-27632 | برنامج تلفزيوني | 1000 X | 10 ملم | 10 ميكرومتر |
| LY2157299 | [دمس] | 10,000 X | 5 مم | 0.5 ميكرومتر |
| CHIR99021 | برنامج تلفزيوني | 1000 X | 2.5 مم | 2.5 ميكرون |
| Wnt3a | برنامج تلفزيوني | 2000 X | 200 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مليلتر |
الجدول 1: جدول الكاشف عامل نمو. ملخص الحلول الأسهم عامل النمو وعمل الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
Discussion
تطوير نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق ويتوسع نماذج مورين السابقة عن طريق السماح لدراسة نقاط زمنية متعددة من إصابة الأنسجة داخل الحيوان نفسه. وهناك عدة نقاط المناقشة الحاسمة لهذا البروتوكول بما في ذلك ربط السفن السليم وضخه الأنسجة وسرداب نجاح زراعة الخلايا.
ربط السفن السليم أمر ضروري لإيجاد نموذج الاسكيمية كاملة. إذا كانت مرتبطة الخياطة موزعة أو المشبك تشديد تماما، لا الدم من الشريان السميكة قد يستمر لإدخال الأنسجة ولا يمكن الخروج منه بسبب انهيار الوريد رقيقة الجدران. ينتج عن هذا التسرب دم إلى بروبريا الصفيحة يسبب تلف الأنسجة الإضافية. ومع ذلك، تبعاً لنوع الإصابة الدماغية قيد الدراسة، قد رغبت في الاسكيمية كاملة أو نزفية. على سبيل المثال، عملية زرع الأمعاء، يفصل الأمعاء تماما من إمدادات الأوعية الدموية (الشريان والوريد) أثناء مرحلة الاستئصال الداخلي، الذي ينتج الاسكيمية المعوية كاملة. بدلاً من ذلك، ومع ذلك، عندما هو الملتوية في مساريق أثناء حدث مثل انفتال الأمعاء، عودة وريدي هو غالباً ما أعاقت أولاً، المؤدية إلى الدم إضافية داخل الأنسجة قبل أن الإمداد الشرياني إعاقة، وبالتالي خلق الاسكيمية النزفية.
الإصابات الدماغية ينتج عن تلف الأنسجة بدءاً من طرف زغابة وتوسيع وصولاً إلى القاعدة من سرداب3. خلال الاسكيمية، لا تزال تستخدم الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ويولد هيبوكسانثيني المستقلب. عندما يتم ريبيرفوسيد الأنسجة بالأكسجين، يصبح استقلاب طريق أوكسيديز زانتيني hypoxanthine وتنتج الجذور الحرة دسموتاز مما أدى إلى إصابة الغشاء المخاطي والجذب من نسيج إتلاف العَدلات17،18. أنواع الاختلافات في بنية الأوعية المخاطية فضلا عن التعبير متفاوتة من أوكسيديز زانتيني، يؤدي إلى درجات متفاوتة من الإصابة ضخه3. نماذج القطط والقوارض من الاسكيمية-الاكسجينيه أكثر عرضه للإصابة ضخه من الأكسجين التفاعلية والايضات19،20. وفي المقابل، تم العثور على الخنازير أقل أوكسيديز زانتيني، وذلك أقل الإصابة ضخه، مما يجعل هذا النموذج أكثر قابلية للمقارنة لأن الاسكيمية المعوية البشرية21. في هذا الوقت، استخدام نماذج الخنزير المعدلة وراثيا لدراسة الإصابة المعوية أو خروج المغلوب لا وصف، مما يجعل هذا قيداً رئيسيا لهذا النموذج. اختيار النموذج الحيوان السليم يعتمد على عملية المرض أو شرط محدد الباحث يرغب في الدراسة. على سبيل المثال، كانت نماذج الخنزير من الإصابات الدماغية تصل إلى 6 ح22من وصف، بينما هي الإجراءات الأكثر الدماغية في نماذج مورين23من 45-60 دقيقة.
يسمح عزل ناجحة من الخبايا المعوية من الأمعاء إيشيميكالي التالفة والعادي للدراسة لاسترداد الظهارية في الثقافة. هذا النظام يسمح للباحث أن يركز فريد ظهارة وحدها، كما أن هناك إمدادات لا الأوعية الدموية أو مكونات الخلايا المناعية للنظر. وهذا يتيح الفرصة لدراسة التفاعلات بين الخلايا الظهارية والانتعاش بعد الإصابة بالإضافة إلى الاستجابة لعوامل النمو المختلفة، أو العلاجات التي يديرها أثناء الجراحة أو عزل سرداب التالية المكمل لوسائط الإعلام الثقافة. وتظل هذه الخطوة الأكثر صعوبة، كما تتطلب عزل من الحلقات لحقت بها أضرار بالغة تهز لطيف والإزالة السريعة للحلول التي تحتوي على يدتا في حال الأقبية تصبح قبل الأوان فصلها. إذا كانت هذه الحلقات من الأمعاء لا تغسل جيدا، الأقبية قد يمكن أن تصبح ملوثة في الثقافة. نتيجة لذلك تمت إضافة حل مضاد حيوي فطري إلى كلا الحلول الدكتور بالإضافة إلى وسائط الإعلام إيسك. نقطة نقاش أخرى تركز على الأمعاء التي يتم جمعها كعنصر تحكم عادي. الأنسجة التحكم حتى "طبيعية" كما الحيوانات الخضوع للتخدير مع التعديلات الممكنة في نضح الأنسجة النظمية، جنبا إلى جنب مع إمكانية تعميم وسطاء التهابات ثانوية الاسكيمية، قد لا تمثل عنصر تحكم حقيقية. في هذه التجارب، أنها ملاحظة أنه يبدو أن الأنسجة مراقبة مماثلة صارخ والأشيع للأنسجة من الحيوانات التي لم تطرأ الاسكيمية في تجارب أخرى (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
وباختصار، يصف هذا الأسلوب نموذج استنساخه من الخنزير الاسكيمية المعوية، أن نماذج عن كثب ما يحدث في الإصابات الدماغية البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يرد وصف لعزل الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية، الذي يعمل على دراسة إصلاح الظهارية واستجابة ممكنة للعلاج في الثقافة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكان هذا المشروع الدعم من K01OD0199 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة T32 OD011130، P30DK034987 المعاهد الوطنية للصحة، وقسم العلوم السريرية نشر الأموال
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
| Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
| Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
| Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
| Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
| Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
| Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
| Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
| Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
| Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
| Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
| Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
| Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
| Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
| Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
| Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
| IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
| Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
| Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
| Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
| Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
| Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
| Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
- Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
- Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).
- Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).
- Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
- Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
- Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
- Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
- Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).
