Summary
Besmettelijke longontsteking is een van de meest voorkomende infecties bij de mens. Een passende in-vivo -model is van cruciaal belang voor het begrijpen van de pathogenese van de ziekte en het testen van de werkzaamheid van roman therapeutics. Met dit model lymfkliertest orofaryngeale aspiratie longontsteking, kan men de pathogenese en nieuwe behandelingen tegen deze dodelijke infecties onderzoeken.
Abstract
Lymfkliertest infectie modellen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de pathogenese van de ziekte en het testen van de werkzaamheid van roman therapeutics ter bestrijding van de causatieve pathogenen. Besmettelijke longontsteking is een van de meest voorkomende infecties die door patiënten in de kliniek en garandeert dus een passende in-vivo -model. Typische longontsteking modellen gebruiken intranasale inoculatie, die deposito's buitensporige organismen buiten de longen, waardoor af-target complicaties en symptomen, zoals sinusitis, gastritis, enteritis, fysieke trauma's of microparticle condens om na te bootsen aërosol verspreiding meer typisch van virale, tuberculose of schimmel longontsteking. Deze modellen komen niet nauwkeurig overeen met de pathogenese van typische Gemeenschap - of gezondheidszorg-verworven bacteriële longontsteking. Daarentegen bootst dit lymfkliertest model van orofaryngeale aspiratie longontsteking het parcours van de druppel in gezondheidszorg opgelopen longontsteking. Enten van 50 µL van de bacteriën veroorzaakt schorsing in de orofarynx van narcose muizen reflexieve aspiratie, wat in longontsteking resulteert. Met dit model kan men onderzoeken de pathogenese van longontsteking-veroorzakende pathogenen en nieuwe behandelingen om deze ziekten te bestrijden.
Introduction
Infectie van de lagere luchtwegen is's werelds dodelijkste overdraagbare ziekten en de meest voorkomende doodsoorzaak in ontwikkelingslanden1. Wereldwijd, deze infecties zijn goed voor meer dan 3.2 miljoen sterfgevallen1. Daarnaast nosocomiale pneumonie behoort tot de gemeenschappelijkste en dodelijke vormen van gezondheidszorg verworven infecties, en wordt veroorzaakt door de meeste antibiotica-resistente pathogenen2,3. De typische route van verwerving van bacteriële longontsteking voor beide Gemeenschap overgenomen en nosocomiale pneumonie is de ambitie van orofaryngeale inhoud in de longblaasjes. Lymfkliertest modellen gebruikt bij het bestuderen van deze ziekten vaak gebruiken intranasale inoculatie4, neerlegging van veel van de bacteriën buiten de longen, waardoor af-target complicaties en symptomen zoals sinusitis en fysieke trauma's, die elkaar met de ziekte progressie in de mens die de modellen zijn ontworpen om te emuleren. Andere modellen kunnen gebruiken inademing chambers en micromisting apparaten, die nauwkeuriger nabootsen schimmel, virale en tuberculose pneumonieën, maar doen niet nauwkeurig de normale route van acquisitie voor typische bacteriële pneumonieën recapituleren.
De lymfkliertest orofaryngeale aspiratie pneumonie model kan worden gebruikt om na te bootsen de natuurlijke route en pathogenese van bacteriële longontsteking. Door inoculating 50 µL van de bacteriële suspensie in de orofarynx van narcose muizen met behulp van een precisiepipet, ontstaat reflexieve aspiratie, wat resulteert in infectieuze longontsteking. Met behulp van dit model, kan men de pathogenese van longontsteking-veroorzakende pathogenen en nieuwe behandelingen ter bestrijding van deze ziekten met een hogere betrouwbaarheid model, meer analoog aan aspiratie pneumonie infecties waargenomen in mens onderzoeken. Bovendien, in tegenstelling tot soortgelijke modellen die door de mondholte5,6 infecteren, dit model zorgt u ervoor dat de volledige entmateriaal de longen in plaats van de darm bereikt, waar het off-site ontstekingen en infecties, zoals gastritis kan veroorzaken en enteritis. Ten slotte, in tegenstelling tot een andere gepubliceerde model dat vereist een Laryngoscoop en inoculates via de luchtpijp7, dit model niet verhindert de luchtwegen met een maagsonde naald en vereist geen injectie voor entmateriaal levering. Inoculatie is daarentegen afhankelijk van de natuurlijke aspiratie reflex van de muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren moeten worden goedgekeurd door de onderzoeker de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC).
1. bereiding van bacteriële entmateriaal
- Isoleren van bacteriële kolonies.
- Streep een bacteriële stam (bijvoorbeeld, A. baumannii "HUMC1") op de drager van passend steriele agar (bval soja agar), voorzichtig om te genereren van geïsoleerde kolonies.
- Incubeer bij passende omstandigheden (bijvoorbeeld's nachts bij 37 ° C).
- Overnachting cultuur te groeien.
- Selecteer een vertegenwoordiger, geïsoleerde kolonie van de agarplaat met een steriele inoculating lus en gebruik het om te enten 10 mL van passend steriele Bouillon medium (bv, al soja Bouillon).
- Toestaan dat de steekproef te bereiken van de stationaire fase op de juiste voorwaarden (bijvoorbeeld, 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts in een geventileerd-cap, 50 mL conische flesje).
- Groeien de subcultuur.
- 100 μl van overnachting cultuur naar 10 mL verse steriele bouillon met behulp van een precisiepipet overbrengen.
- Toestaan tot exponentiële/log fase bij de juiste voorwaarden (bijvoorbeeld, 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 3 uur in een geventileerd-cap, 50 mL conische flesje).
- Wassen van de subcultuur.
- Verwijder de subcultuur van de drachtige omgeving.
- Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 5 min naar de pellet van de bacteriën.
- Gecombineerd en verwijder het supernatant.
- Voeg 10 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar de pellet en vortex krachtig tot volledig geresuspendeerde.
- Herhaal stap 1.4.2 - 1.4.4 tweemaal, voor een totaal van 3 wasbeurten.
- Aanpassen van de concentratie van bacteriële suspensie.
- Met behulp van een spectrofotometer die meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600), meten van de extinctie van de bacteriële suspensie.
- Voeg steriel PBS tot de bacteriële schorsing totdat de optische dichtheid van het entmateriaal zakt naar een OD600 van 0,5, met behulp van de vergelijking Cik× Vik = Cf× Vf, waarbij "C" staat voor concentratie, "V" = volume, "ik" is eerste, en "f" is definitief. * Cf moet altijd 0,5; V-f is de variabele op te lossen.
- Als de bacteriële vering zakt tot onder een OD600 van 0,5, Centrifugeer het bij 4.000 × g gedurende 5 min pellet de bacteriën en verwijderen van een passend bedrag van de bovendrijvende substantie te bereiken een OD600 van 0,5.
- Uitvoeren van seriële verdunningen in steriele PBS (b.v., drie 1:100 verdunningen te bereiken van 1 × 10-6) en plaat op steriele agar te bepalen van de correlatiecoëfficiënt dat de bacteriële concentratie in de kolonie-vormende openbaart eenheden per mL (CFUs/mL) bij een OD600 van 0,5.
Opmerking: De waarde van deze correlatiecoëfficiënt zal variëren voor elke stam van elke soort en moet worden bepaald vóór entmateriaal voorbereiding voor een infectie. - Na het bepalen van de correlatiecoëfficiënt, gebruiken om het maken van een entmateriaal van de gewenste concentratie (b.v., 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); Als de gewenste entmateriaal groter dan de OD600 van 0,5 is, centrifugeer de bacteriële schorsing bij 4.000 × g gedurende 5 min pellet de bacteriën en verwijderen van een passend bedrag van het supernatans dat tot de gewenste concentratie.
- Uitvoeren in vivo pilotstudies om te bepalen van de virulentie van elke bacteriële isolaat in elke stam van muis, aangezien deze waarden tussen bacteriële isolaten van dezelfde soort en muizen van verschillende genetische achtergronden variëren zullen. Voor verschillende gram-negatieve soorten is de LD-100 in muizen over het algemeen 1-5 × 108 CFUs/muis, hoewel bepaalde stammen dodelijk in lagere entmateriaal zijn.
- Bevriezen identiek aliquots voor toekomstig gebruik als entmateriaal op afroep, precies, als eerder gepubliceerde8 (optioneel).
- Bereiden 1 L van bacteriële entmateriaal als hierboven, overdracht naar twee conische flesjes van 500 mL, of centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 5 min.
- Negeren van 450 mL van het supernatans van elke conische flacon en resuspendeer de pellets van bacteriën in het resterende supernatant.
- De geconcentreerde bacteriële entmateriaal overbrengen in een bekerglas van 250 mL met een magnetische roer bar en continu mengen op de top van een bord roer bij 300 omwentelingen per minuut.
- Zorgvuldig overbrengen precies 600 μL van geconcentreerde bacteriële entmateriaal (bijvoorbeeld, 1 × 1010 CFUs/mL) met behulp van een precisiepipet aan een 1.6-mL cryogene flacon met precies 300 μL van steriele H2O en 300 μL van steriele glycerol; Meng en opslaan bij-80 ° C.
Opmerking: De glycerol nodig voor opslag kunt verwarren de experimentele resultaten en overtollige sterfte veroorzaken, dus het is noodzakelijk om te wassen het. - Wanneer klaar voor gebruik, ontdooien het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- 1 mL overbrengen in een conische flacon van 50 mL, voeg 9 mL steriele PBS en centrifuge bij 4.000 × g gedurende 5 min naar de pellet van de bacteriën. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de vooraf bepaalde hoeveelheid CFUs (1 mL × bevroren voorraad concentratie in CFUs/mL) in een passende omvang van PBS te bereiken van de gewenste concentratie van besmettelijke entmateriaal.
2. anesthetizing muizen
- Ketamine/Xylazine
Opmerking: Anesthesie met ketamine/xylazine heeft een lange duur, die genoeg tijd voor de onderzoeker die nieuw is bij deze techniek de inoculatie procedure uitvoeren biedt voordat de muis ontwaakt.- 10 mL van injecteerbare oplossing voor te bereiden door het combineren van 8,5 mL van pharmaceutifcal rang PBS, 1 mL 100 mg/mL stockoplossing van Ketamine (eindconcentratie 10 mg/mL), en 0,5 mL 20 mg/mL stockoplossing van Xylazine (eindconcentratie 10 mg/mL).
- 10 μL/g beheren door intraperitoneale injectie van (IP) (bijv., 250 μL voor een 25-g-muis).
- Ophthalmic zalf toepassen door de ogen van de muizen verdoofd met Ketamine/Xylazine, want hun ogen gevoelig zijn voor schade tijdens langere perioden van de verdoving.
- Plaats de muis in een kooi en volgen totdat het wakker uit de narcose.
Opmerking: Het dier mag niet worden overgelaten zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen.
- Isofluraan
Opmerking: Muizen snel wakker uit narcose Isofluraan-geïnduceerde na wordt verwijderd uit de zaal inductie, zodat deze methode van anesthesie mag alleen worden gebruikt nadat ze zijn bedreven in de inoculatie procedure geworden.- Plaats de naïeve muizen in een gepaste afmetingen inductie kamer met zuurstof stroomt.
- Nadat de kamer verzegeld afsluiten is, anesthetize de muizen met behulp van een vaporizer precisie toe te voegen Isofluraan op 4% (v/v) voor minstens 5 min; bevestigen van de narcose door het verwijderen van een muis in de zaal van de inductie en meten hoe lang het duurt om wakker uit narcose (~ 60 s).
Opmerking: Let erop dat verdoving tijden kunnen variëren op basis van institutionele richtsnoeren en sommige dieren meer dan 5 min vereisen kunnen te worden volledig verdoofd. - Handhaven van de narcose gedurende maximaal 10 minuten door het aanpassen van de concentratie van Isofluraan tot 2-3%; Als de totale duur van de verdoving is > 15 min, oogheelkundige zalf toepassen in de ogen van narcose muizen.
- Plaats de muis in een kooi en volgen totdat het wakker uit de narcose, zoals in stap 2.1.
3. enten/infecteren muizen
- Een narcose muis op te schorten, het opknoping door zijn bovenste snijtanden op een sterke, dunne snaar (b.v., tandzijde) beveiligd aan een vast object op een hoogte van ongeveer tweemaal van de muis lichaamslengte (b.v.20 cm) boven het operationele oppervlak (bijvoorbeeld laboratorium Bank).
- Trek voorzichtig van de muis tong uit de mond met behulp van steriele, blunt-ended pincet. De tong overbrengen in een steriele, gehandschoende vinger om te voorkomen dat per ongeluk breken van de tong van de muis. Houd de tong buiten de mond, zodat de toegang tot de orofarynx en het voorkomen van de slikken van het entmateriaal naar de kant.
- Houd de muis op de tong en de 50-μL entmateriaal (bacteriële suspensie) te plaatsen in de orofarynx met behulp van een micropipet; de orofarynx ligt op de kruising van de mondholte en de keelholte naar de achterkant van de mond.
Opmerking: Het is zeer belangrijk om alleen vloeistof door pipetteren tot de eerste halte op de micropipet. De muis zal stoppen met ademhalen voor een paar seconden wanneer het entmateriaal wordt geplaatst in de orofarynx; reflexieve aspiratie zal uiteindelijk de muis om in te ademen de bacteriële schorsing, aangegeven door het kenmerkende knetterend lawaai van vloeistof invoeren van de longen, wat in longontsteking infectie resulteert veroorzaken. - Indien het entmateriaal niet ver ligt terug genoeg om normale ademhaling blokkeren, knijpen de neusgaten met een tang te dwingen reflexieve inademing via de mond en de volgende inademing van het entmateriaal.
- Na inoculatie, vrijgeven van de tong, verwijder de muis uit de schorsing tekenreeks, plaatst u deze in een kooi en volgen totdat het wakker uit de narcose, zoals in stap 2.1.
4. toezicht progressie van de ziekte
Opmerking: Als gevolg van dierenleed, verschillende indicatoren moeten worden gebruikt om aan te geven wanneer er muizen komen stervende; euthanasie moet worden uitgevoerd na deze vaststelling, overeenkomstig een eerder goedgekeurde protocol van de IACUC; verschillende merkers van moribundity zijn lichaamstemperatuur, gewichtsverlies, uiterlijk, gang en andere biomarkers die kunnen worden verkregen uit bloed (bijvoorbeeld via iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- De muizen volgens eerder goedgekeurde IACUC protocol (b.v., CO2 gevolgd door cervicale dislocatie) euthanaseren.
- Verwijder de longen uit euthanized mouse door het snijden van de luchtpijp, de longslagader en de longader dicht bij de longen.
- Microscopie
- Plaats de longen (of deel) in een mal van het specimen.
- Vul de specimen schimmel met optimale snijden temperatuur (O.C.T.) verbinding, volledig ondergedompeld het weefsel.
- Bevriezen van het monster bij-80 ° C.
- Het monster verzenden door een laboratorium van de pathologie afdeling te monteren op de dia's voor microscopie.
- Bacteriële belasting
- Weeg het longweefsel op een analytische balans.
- Het longweefsel overbrengen conische flacon 50 mL met 2-5 mL steriele PBS (afhankelijk van de grootte van het weefsel).
- Meng het longweefsel met een homogenizer weefsel.
- Seriële verdunningen van het homogenaat in steriel PBS tot ongeveer 1000 CFUs/mL, gebaseerd op verwachte bacteriële belasting in longen uitvoeren.
- Bijvoorbeeld, als 1 × 109 CFUs/mg wordt verwacht, voert u drie 1:100 verdunningen: Transfer 100 μL van homogenaat 9.9 ml PBS en vortex; Dit is de eerste 1:100 verdunning. 100 μl van de eerste 1:100 verdunning overbrengen 9.9 mL PBS en vortex; Dit is de tweede 1:100 verdunning. 100 μl van de tweede 1:100 verdunning overbrengen 9.9 mL PBS en vortex; Dit is de derde en laatste 1:100 verdunning.
- Als bacteriële belasting in de longen onbekend is, voert een reeks verdunningen te vangen van het verwachte bereik.
- Plaat dilution(s) op steriele agar.
- Bereiden van steriele al soja Bouillon (TSB) met agar (TSA) platen: combineren TSB 30 g 15 g agar en 1 L water, meng met een magneetroerder, en verhit tot koken bij ~ 100 ° C gedurende 5 min. toestaan afkoelen en vervolgens autoclaaf op vloeibare cyclus voor 15 min. toestaan afkoelen tot ~ 55 ° C, transfer 10 mL vers gesteriliseerde met autoclaaf TSA aan steriele petrischalen en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Laat droog benchtop voor 2-5 d of ongedekte onder een kast voor 10 min bioveiligheid.
- 100 μl van de verdunning overbrengen in een petrischaal met steriele TSA en verspreid over TSA met behulp van een spreider of glazen kralen.
- Opslaan van de petrischaal 's nachts bij 37 ° C in een bevochtigde incubator (d.w.z., 37 ° C incubator met een ongedekte 1-L-bekerglas gevuld met water)
- Bepalen CFUs/mL Long homogenaat gebaseerd op agar beplating (bv100 CFUs op TSA plaat met 100 μl van de derde en laatste verdunning hierboven beschreven zou 100 CFUs/100 μl × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Berekenen van CFUs/mg longweefsel gebaseerd door het verdelen van de CFUs/mL Long homogenaat door mg Long weefsel/mL homogenaat (bijvoorbeeldals voorbeeld hierboven beschreven 100 mg van longweefsel gehomogeniseerd in 5 mL PBS, dan 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 gebruikt CFUs/mg).
- Microscopie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het protocol nauwgezet te volgen, kan reproduceerbaar zijn en robuuste gegevens gemakkelijk worden verkregen. Het is van cruciaal belang zich strikt houden aan iemands aangepast entmateriaal voorbereiding protocol voor experimenten worden vergeleken met een elkaar. Het is ook belangrijk om goed muizen tijdens de procedure van de infectie. Zorg ervoor dat muizen in een kamer van de verdoving verstoken van Isofluraan plaatsen. Muizen zullen raak in paniek als ze worden geplaatst in een kamer die is vooraf gevuld met Isofluraan en teveel stress, die eventueel in gevaar experimentele resultaten brengen kan kunnen ervaren. Na het veiligstellen van de deksel van de container, voeren langzaam Isofluraan door oplopend op de concentratie van 0% tot 4% (v/v); haastig beheren Isofluraan kan ook muizen tot paniek. Zodra de muizen onbewuste geworden, verminderen de concentratie Isofluraan tot 2-3% (v/v) en laten in de bedwelmingsruimte blijven voor een extra paar minuten. Op dit punt, muizen zijn klaar om te worden besmet (Figuur 1).
Verwijder een muis uit de narcose zaal en schorten door zijn bovenste snijtanden toegang te verlenen tot de tong (Figuur 2). Gebruik bot-ended pincet te Trek voorzichtig uit de tong (Figuur 3) dan worden de pincet-gehouden tong overbrengen in een steriele, gehandschoende vingers (Figuur 4) om te voorkomen dat trauma's van de muis tong. Met de tong nog steeds buiten de mond, door het entmateriaal 50-µL te overbrengen in de orofarynx (Figuur 5). Hier is het heel belangrijk om alleen leveren vloeistof door pipetteren tot de eerste halte op de micropipet. Blijven de tweede halte, kunt een grote zeepbel in de entmateriaal dat met de infectie interfereert introduceren.
Zodra de infectie voltooid is, zijn er een groot aantal opties voor het testen van muizen. Voor pathogenese studies, kunt vergelijken met een niet-geïnfecteerde om geïnfecteerd weefsel (Figuur 6). Als de effectiviteit van roman therapeutics worden geanalyseerd, kan een verwijderen van de longen en hebben ze gesegmenteerd en gekleurd. Dit kan worden gedaan op een tijdstip of op meerdere tijdstippen te tonen van de progressie van de ziekte (Figuur 7).
Een andere optie is om te beoordelen in de longen van geïnfecteerde muizen de bacteriële belasting. Dit wordt gedaan door het verwijderen van de longen, overbrengen naar een flesje met een bekend volume van steriele PBS, vervolgens met de homogenizer van een weefsel (spoelen tussen elk monster ter voorkoming van kruisbesmetting) homogenisatie. Plating seriële verdunningen van het homogenaat Long op voedselrijke agar kan voor de berekening van de CFUs/mL voor elke Long homogenaat en vervolgens CFUs/mg longweefsel (Figuur 8). Dit, kan ook worden gedaan op een tijdstip of op meerdere tijdstippen te tonen van de progressie van de ziekte.
Er zijn talloze andere tests die kunnen worden uitgevoerd, met inbegrip van cytokine analyses (Figuur 9), sepsis biomarkers door iSTAT (Figuur 10), stroom cytometry te onderzoeken cel oppervlakte markers, mobiele profiling, RNAseq, enz.
Figuur 1 : Bepalen van LD100. Het is noodzakelijk te infecteren muizen met verschillende entmateriaal concentraties voor het bepalen van de LD-100. Hier, het entmateriaal 2 × 10-8 CFUs/muis is te hoog, 5 × 10-7 en 2 × 107 zijn te laag en 1 × 10-8 is precies goed.
Figuur 2 : Hang muizen door bovenste snijtanden. Nadat de muizen zijn verdoofd, één muisklik verwijderen uit de zaal inductie, (A) gebruik van pincet te trekken uit een lus van string 20-30 cm boven het werkvlak, beveiligd (B) verplaatsen van de tekenreeks achter de bovenste snijtanden van de muis, (C) zorgen de tekenreeks achter de bovenste snijtanden, is beveiligd en (D) laat de muis door zijn bovenste snijtanden hangen de lus van de tekenreeks.
Figuur 3 : Trek van de tong uit de mond met pincet en overdracht greep naar gehandschoende vingers. Na de muis opknoping door zijn bovenste snijtanden, (A) gebruik van pincet voorzichtig begrijpen van de muis tong, (B) Trek voorzichtig uit de tong, de ()C) zorgvuldig overbrengen in de tong van de verlostang gehandschoende vingers om te voorkomen dat trauma's van de muis tong, en (D) de tong op zijn plaats met gehandschoende vingers houden. Zorg ervoor dat u genoeg druk om te voorkomen dat de tong glijden terug in de mond maar niet zo veel druk dat trauma ontstaat. De tong moet plaatsvinden buiten de vlinder en aan de kant te voorzien van micropipet toegang in de volgende stap. Op dit punt, is de muis klaar voor infectie.
Figuur 4 : De muis infecteren. Behoud de tong buiten de mond, gebruik een micropipet om de 50-µL entmateriaal naar de orofarynx. Plaats het uiteinde van de pipet in de mond aan de achterkant van de tong en afzien van de bacteriële schorsing, alleen gaat naar de eerste top op de micropipet; Ga niet naar de tweede halte zoals dit kan een grote zeepbel introduceren in het entmateriaal die met volledige aspiratie interfereren kan.
Figuur 5 : Opname van gezonde (niet-geïnfecteerde) vs besmet longweefsel. De Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring van longkanker secties voor en na de orofaryngeale aspiratie van A. baumannii, die de route van de ventilator-geassocieerde longontsteking (VAP) recapituleert, wat resulteert in overlijden meestal binnen 1-3 dagen en aanzienlijke alveolaire ontsteking zoals hier te zien.
Figuur 6 : Beoordelen van bacteriële belasting; herdrukt en bewerkt met toestemming14 . Verwijder na het infecteren van muizen, longen door dissectie na succesvolle euthanasie met inachtneming van de toepasselijke IACUC-protocol. Verzamelen van de massa van het longweefsel, overbrengen in een flesje met een bekend volume (2-5 mL) van steriele PBS en meng met de homogenizer van een weefsel. Zorg ervoor dat de homogenizer met ethanol en steriele PBS tussen elk monster ter voorkoming van kruisbesmetting spoelen. Uitvoeren van seriële verdunningen van het homogenaat longkanker en plaat verschillende verdunningen op voedselrijke agar en broeden op de juiste manier voor het gekozen pathogeen. Berekenen van de CFUs/mL voor elke Long homogenaat gebaseerd op CFUs/plaat × verdunning, en vervolgens wordt gedeeld door de mg Long weefsel/mL Long homogenaat. Dit kan worden gedaan op een tijdstip of op meerdere tijdstippen te tonen van de progressie van de ziekte. Medianen worden weergegeven met foutbalken vertegenwoordigen interquartile bereiken. p < 0,05 behandeld vs. onbehandelde groep.
Figuur 7 : Opname van besmette longweefsel, onbehandeld vs behandeld; herdrukt en bewerkt met toestemming14 . Verwijder na het infecteren van muizen, longen door dissectie na succesvolle euthanasie met inachtneming van de toepasselijke IACUC-protocol. Op de juiste wijze bewaren van het weefsel (bijvoorbeeld, ondergedompeld in optimale snijden temperatuur gel en bevroren bij-80 ° C) vervolgens verzenden pathologie lab of ander bekwaam persoon voor segmenteren en kleuring. Dit kan worden gedaan op een tijdstip of op meerdere tijdstippen te tonen van de progressie van de ziekte.
Figuur 8 : Analyse van de Cytokine; herdrukt en bewerkt met toestemming14 . Als u wilt analyseren circulerende cytokines, voldoende bloed (b.v., 50 µL via staart plukt) aanschaffen, laat stollen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, centrifuge op 1000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en het verzamelen van serum supernatant. Het serum kan vervolgens door Luminex multiplex voor cytokines worden geanalyseerd. Dit kan worden gedaan op een tijdstip of op meerdere tijdstippen te tonen van de progressie van de ziekte. Medianen worden weergegeven met foutbalken vertegenwoordigen interquartile bereiken. p < 0,05 behandelde vs. onbehandelde groep op hetzelfde tijdstip.
Figuur 9 : Sepsis biomarkers; machtiging herdrukt en gemodificeerde met14 . Analyseren van sepsis biomarkers, 75 µL bloed (bvvia staart plukt) aanschaffen en snel overbrengen naar een iSTAT cartridge die controleert of gewenste analyten. Dit kan worden gedaan op een tijdstip of op meerdere tijdstippen te tonen van de progressie van de ziekte. Medianen worden weergegeven met foutbalken vertegenwoordigen interquartile bereiken. p < 0,05 behandelde vs. onbehandelde groep op hetzelfde tijdstip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om zeker te zijn, zijn muizen niet miniatuur mens. Muismodellen verkregen resultaten moeten worden beschouwd in de context en vervolgens geïnterpreteerd voor toepasbaarheid voor de mens, op basis van verschillen en overeenkomsten tussen de twee soorten6. Het is ook belangrijk om te kiezen van de juiste muis stam als bepaalde zijn meer vatbaar voor sommige infecties dan andere; hetzelfde geldt voor de pathogene stam van keuze16.
Het is essentieel voor het uitvoeren van infecties in een veeleisende en zeer reproduceerbare manier. Entmateriaal kan dodelijk zijn voor muizen op één waarde nog onschadelijk tegen zelfs 90% van deze waarde. Het is dus noodzakelijk dat alle voorwaarden vermeld in dit protocol worden gereproduceerd in exact dezelfde manier, met name bij de voorbereiding van het entmateriaal en wanneer infecteren. Daarnaast zal elke pathogenen ziekte op een unieke entmateriaal veroorzaken. Het is daarom noodzakelijk voor het uitvoeren van proefprojecten om te bepalen van de juiste entmateriaal voor elke stam van pathogenen en in elke soort muis.
Met gram-negatieve bacteriën volstaat een entmateriaal ≤5 × 108 CFUs/muis om dood te veroorzaken bij virulente stammen. Het is aangeraden om geen gebruik van stammen die niet-dodelijke bij ≤1 × 109 CFUs/muis, omdat ze suggereren dubieuze relevantie voor pathogenese gebaseerd op enorme hoeveelheid materiaal wordt geplaatst in de longen16.
In vergelijking met anderen, er zijn zeer weinig technische complicaties voor het model van orofaryngeale aspiratie pneumonie en reproduceerbaarheid is veel groter. Slechts één kleine complicatie van de modelresultaten wanneer de oppervlaktespanning rond de 50-µL entmateriaal in de orofarynx geplaatst voorziet nasale ademhaling, uitschakeling van aspiratie-de oorzaak van de infectie. In dit geval dwingt gewoon knijpen de neusgaten met een tang reflexieve aspiratie via de mond en de volgende inademing van het entmateriaal voor het opwekken van besmettelijke longontsteking. Dit is echter een technische fout door de technicus, die gemakkelijk met minimale praktijk wordt vermeden.
In termen van de relevantie ervan voor ziekten bij de mens is het een beperking van dit model, net als andere modellen van gram-negatieve bacteriële infecties, de snelheid van de progressie van de ziekte. Mensen zijn zelden besmet met een grote bolus van een bacteriële suspensie, vandaar dat muizen de voortgang naar de ziekte zo snel. Echter ondergaan alle FDA-goedgekeurde behandelingen dergelijke vertoningen translationeel onderzoek in diermodellen om te beoordelen hun therapeutisch potentieel alvorens ze naar de klinische proeven bij de mens. Ironisch genoeg, de snelheid van het model is ook een aantrekkelijke eigenschap, omdat het duidelijkheid over de therapeutische werking binnen een korte periode van tijd verschaffen kan.
Geen lymfkliertest model is perfect, maar dit is een model met de mogelijkheid om getrouw emuleren de route van infectie en pathogenese van ziekten bij de mens en het beoordelen van de effectiviteit van potentiële therapeutics, waardoor voor de snelle vertaling van nieuwe therapieën dat zijn hard nodig in de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases op de National Institutes of Health [Grant nummers R01 AI117211, R01 AI130060 R21 AI127954 en R42 AI106375 aan BS] en de Amerikaanse Food and Drug Administration [Contract HHSF223201710199C naar BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
