Summary
감염 성 폐 렴은 인간에서 가장 일반적인 감염 중 하나입니다. 적절 한 생체 내에서 모델은 질병 병 인을 이해 하 고 새로운 치료제의 효능을 테스트 중요 합니다. 이 murine oropharyngeal 포부 폐 염 모델 하나 pathogenesis 및 이러한 치명적인 감염에 대 한 새로운 치료를 확인할 수 있습니다.
Abstract
Murine 감염 모델이 질병 병 인을 이해 하 고 원인 병원 체에 대처 하기 위해 설계 된 새로운 치료제의 효능을 테스트 합니다. 감염 성 폐 렴 환자가 병원에서 제시한 가장 흔한 감염 중 이며 따라서 적절 한 생체 내에서 모델을 보증. 일반적인 폐 렴 모델 사용 대상에서 합병증과 증상, 축 농 증, 위 염, 장 염, 물리적 외상, 또는 microparticle 모방에 어로 졸 스프레이 등을 일으키는 폐 밖에 과도 한 유기 체를 예금 intranasal 접종 바이러스 성, 결핵, 또는 곰 팡이 폐 렴의 전형적인 확산. 이러한 모델 전형적인 지역 사회 또는 의료 획득 세균성 폐 렴의 병 인을 정확 하 게 반영 하지는 않습니다. 반면, oropharyngeal 포부 폐 염의이 murine 모델 의료 획득 폐 렴의 물방울 경로 모방합니다. 박테리아의 50 µ L를 접종 마 취 쥐의 oropharynx에 정지 하면 재귀 포부를 폐 렴. 이 모델을 사용 하나는 폐 렴을 일으키는 병원 체와이 질병에 대처 하기 위해 새로운 치료법의 병 인을 확인할 수 있습니다.
Introduction
더 낮은 호흡 감염 세계의 치명적인 전염 성 질병 및 개발 도상국1죽음의 가장 일반적인 원인입니다. 세계적으로, 이러한 감염 3.2 백만 이상 죽음1에 대 한 계정. 또한, 병원내 폐 렴 의료 인수 감염의 가장 일반적이 고 치명적인 형태 중 이며 가장 항생제 내성 병원 체2,3에 의해 발생 합니다. 모두 지역 사회 획득 세균성 폐 렴 및 병원내 폐 렴의 수집의 일반적인 경로 폐 포에 oropharyngeal 내용의 포부입니다. 종종 이러한 질병을 연구 하는 데 사용 하는 murine 모델 사용 intranasal 접종4, 입금 대상에서 합병증과 축 농 증 및 물리적 외상, 질병과 일치 되지 않은 같은 증상을 일으키는 폐 밖에 박테리아의 많은 모델은 인간의 진행 에뮬레이션 하도록 설계 되었습니다. 다른 모델은 흡입 챔버 및 micromisting 장치, 더 정확 하 게 바이러스, 결핵, 그리고 곰 팡이 pneumonias 모방 하지만 전형적인 세균성 pneumonias 획득의 정상적인 경로 정확 하 게 정리 하지 않습니다 사용할 수 있습니다.
Murine oropharyngeal 포부 폐 염 모델 자연 경로 및 세균성 폐 렴의 병 인을 시뮬레이션 하기 위해 활용 될 수 있습니다. 접종 50 µ L를 피 펫을 사용 하 여 마 취 쥐의 oropharynx에 세균 현 탁 액의,에 의해 반사 포부 인가요, 전염 성 폐 렴에서 결과. 이 모델을 사용 하 여, 하나는 폐 렴을 일으키는 병원 체와 높은 충실도 모델, 더 유사한 포부 폐 렴 감염 인간에서 관찰 된 이러한 질병에 대처 하기 위해 새로운 치료법의 pathogenesis를 확인할 수 있습니다. 또한, 비슷한 모델을 구강5,6감염, 달리이 모델 하면 전체 inoculum 그것 오프 사이트 염증과 감염, 위 염 등을 일으킬 수 있습니다 창 자 대신 폐에 도달 하면 그리고 장 염입니다. 마지막으로, 다른 게시 된 모델 요구는 후 두 경 하 고 기도7접종, 달리이 모델 gavage 바늘으로 기도 방해 하지 않습니다 그리고 inoculum 배달에 대 한 주입을 필요로 하지 않습니다. 대신, 접종 마우스의 자연 포부 반사에 의존합니다.
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Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 연구원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인을 받아야 한다.
1입니다. 세균성 Inoculum의 준비
- 세균성 식민지를 격리 합니다.
- 행진 (예를 들어, A. baumannii "HUMC1") 적절 한 살 균 한 천 매체 (예를 들어, Tryptic 간장 agar)에 세균성 긴장 되 주의 고립 된 식민지를 생성 하 고.
- 적절 한 조건 (예를 들어, 37 ° C에서 하룻밤)에 품 어.
- 숙박 문화를 성장.
- 대표, 메 마른 inoculating 루프와 한 천 배지에서 고립 된 식민지를 선택 하 고 그것을 사용 하 여 적절 한 살 균 국물 매체 (예를 들어, Tryptic 간장 국물) 10 mL를 접종 하.
- 적절 한 조건 (예를 들어, 통풍 모자, 50 mL 원뿔 유리병에 하룻밤 200 rpm에서 떨고 37 ° C)에서 고정 단계에 도달 하는 샘플을 수 있습니다.
- Subculture 성장.
- 피 펫을 사용 하 여 신선한 메 마른 국물의 10 mL를 100 μ의 숙박 문화를 전송 합니다.
- 지 수/로그 단계는 적절 한 조건 (예를 들어, 통풍 모자, 50 mL 원뿔 유리병에 3 h 200 rpm에서 떨고 37 ° C)에 도달 하실 수 있습니다.
- Subculture 워시.
- Subculture incubating 환경에서 제거 합니다.
- 박테리아를 작은 5 분 4000 × g에서 원심.
- 발음 하 고는 상쾌한 삭제.
- 펠 릿을 완전히 resuspended 때까지 적극적으로 소용돌이의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 10 mL를 추가 합니다.
- 총 3 세척 단계 1.4.2-1.4.4 두 번 반복 합니다.
- 세균 현 탁 액의 농도 조정 합니다.
- 600에서 광학 밀도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm (OD600), 세균 현 탁 액의 광학 밀도 측정.
- 살 균 PBS 세균 현 탁 액에는 inoculum의 광학 밀도 0.5, OD600 에 떨어질 때까지 사용 하 여 추가는 방정식 C나× Vi = Cf× Vf, "C"는 농도, "V"는 "나" 볼륨 초기, 최종 "f"입니다. * Cf 항상 0.5; 되어야 Vf 는 변수를 해결 하기 위해입니다.
- 세균 현 탁 액 0.5 세600 떨어지면, 작은 박테리아와 0.5 세600 를 도달 하는 상쾌한의 적절 한 금액을 제거 5 분 4000 × g에서 원심.
- (예를 들어, 1 × 10-6을 달성 하기 위해 3 1: 100 희석) 살 균 PBS에 직렬 희석을 수행 및 식민지 형성 세균 농도 보여 상관 계수를 결정 하기 위해 살 균 한 천에 접시 (CFUs/mL) 당 단위 에는 OD600 0.5의.
참고:이 상관 계수 값 각 종족의 각 변형에 대 한 달라 집니다 및 감염에 대 한 inoculum 준비 전에 결정 되어야 합니다. - 상관 계수를 결정 한 후 원하는 농도 (예를 들면, 2 × 108-1 × 109 CFUs/mL);의 inoculum을 만드는 데 사용 원하는 inoculum OD600 0.5 보다 크면, 원심 작은 박테리아와 원하는 농도 도달 하는 상쾌한의 적절 한 금액을 제거 5 분 4000 × g에서 세균 현 탁 액.
- 이러한 값은 동일한 종의 세균 분리와 다른 유전 배경의 마우스 사이 달라 집니다 마우스의 각 변형에 세균 분리 각의 독성 확인 vivo에서 파일럿 연구를 수행 합니다. 다양 한 그람 음성 종족에 대 한 LD100 마우스에는 일반적으로 1-5 × 108 CFUs/마우스, 특정 긴장은 낮은 inocula에 치명적인.
- 이전에 게시8 (옵션) 필요 시, 정확한 inocula로 나중에 사용할 동일한 aliquots를 고정 합니다.
- 두 500 mL 원뿔 튜브, 및 4000 × g에서 원심 분리기는 5 분, 위에서 설명한 전송으로 세균성 inoculum 1 리터를 준비 합니다.
- 각 원뿔 유리병에서 상쾌한의 450 mL를 폐기 하 고 나머지 상쾌한에 박테리아의 펠 릿 resuspend.
- 마그네틱 볶음 bar가 포함 된 250 mL 비 커에 집중된 세균 inoculum을 전송 하 고 지속적으로 300 rpm에서 저 어 접시 위에 섞으십시오.
- 신중 하 게 집중된 세균성 inoculum (예를 들어, 1 × 1010 CFUs/mL)의 정확 하 게 600 μ 전송 포함 하는 살 균 H2O의 정확 하 게 300 μ와 300 mL 1.6 극저온 유리병에는 피 펫을 사용 하 여 살 균 글리세롤;의 μ 믹스와-80 ° c.에 게
참고: 저장을 위해 필요한 글리세롤 실험 결과 혼동 하 고 그래서 그것을 씻어 필요가 초과 사망을 일으킬 수 있습니다. - 때 사용 하기 위해 준비, 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 녹여.
- 1 mL 50 mL 원뿔 유리병에 전송, 작은 공의 박테리아를 5 분 동안 4000 × g에서 살 균 PBS, 그리고 원심 분리기의 9 mL를 추가 합니다. 상쾌한 발음 하 고 감염 inoculum에 대 한 원하는 농도 도달 하는 PBS의 적절 한 볼륨에서 미리 정해진된 양의 CFUs (1 mL × CFUs/mL에서 재고 농도 냉동) resuspend.
2. 마비 쥐
- 케 타 민/Xylazine
참고: 케 타 민/xylazine와 마 취 마우스 일어나 야 하기 전에 접종 절차를 완료 하려면이 기술에서 새로운 연구에 대 한 충분 한 시간을 제공 하 긴 기간, 있다.- Pharmaceutifcal 학년 PBS, 100 mg/mL 마 취 제 재고 솔루션의 1 mL의 8.5 mL를 결합 하 여 주사 솔루션의 10 mL를 준비 (최종 농도 10 mg/mL), 그리고 20 mg/mL Xylazine 재고 솔루션의 0.5 mL (최종 농도가 10 mg/mL).
- (예를 들어, 25-g 마우스에 대 한 250 μ) 복 (IP) 주입에 의해 10 μ/g를 관리 합니다.
- 그들의 눈은 마 취의 연장된 기간 동안 손상 하는 경향이 있기 때문에 케 타 민/Xylazine와 함께 취 쥐의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 에 마우스를 놓고 마 취에서 깨어났을 때까지 모니터 합니다.
참고: 동물 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지.
- Isoflurane
참고: 마우스 빨리 일어나 isoflurane 유도 마 취에서 접종 절차에서 숙련 되 고 마 취의이 메서드를 사용 해야만 유도 약 실에서 제거 되 고 후.- 산소 흐르는와 적절 한 크기의 유도 실에서 순진한 마우스를 놓습니다.
- 챔버 봉인된 종료 후 anesthetize isoflurane 4% (v/v) 적어도 5 분;에 대 한 추가 정밀 기화 기를 사용 하 여 마우스 마 취 유도 실에서 마우스를 제거 하 고 마 취에서 깨어나 하는 데 걸리는 시간을 측정 하 여 확인 (~ 60 s).
참고: 기관 지침에 따라 마 취 시간이 다를 수 있습니다 및 일부 동물 되 완전히 마 취를 5 분 이상 필요할 수 있습니다 다는 것을 유의 하십시오. - 2-3%; isoflurane 농도 조정 하 여 최대 10 분 동안 마 취를 유지 마 취 총 기간은 경우 > 15 분, 마 취 쥐의 눈에 안과 연 고를 적용.
- 에 마우스를 놓고 단계 2.1에서 마 취에서 깨어났을 때까지 모니터 합니다.
3. 접종/감염 쥐
- 마 취 마우스를 일시 중단, 약 두 번 마우스의 몸 길이 (예를 들어, 20 cm) (예: 운영 표면 위에 높이에 고정 된 개체에 보안 강한, 얇은 문자열 (예:, 민트향)에 그것의 위쪽 앞 니에 의해 그것을 거 실험실 벤치).
- 살 균, 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 그것의 입에서 마우스의 혀는 부드럽게 당겨. 마우스의 혀의 우연한 분쇄를 방지 하기 위해 살 균, gloved 손가락을 혀를 전송 합니다. oropharynx에 액세스할 수 있도록 하 고 방지 측면 inoculum의 삼 키는 입 밖으로 혀를 잡으십시오.
- 마우스의 혀를 누른 oropharynx micropipette;를 사용 하 여 50 μ inoculum (세균성 중지) 장소 oropharynx는 구강과 인 두는 입의 뒤쪽의 교차점에 위치 해 있습니다.
참고: 그것은 매우만 micropipette에 첫 번째 정류장에 pipetting으로 액체를 제공 하는 것이 중요입니다. 마우스는 inoculum oropharynx;에 배치 되는 때 몇 초 동안 호흡을 중지 합니다. 결국, 재귀 포부 폐 렴 감염 귀착되는 폐를 입력 액체의 독특한 딱딱거리는 소음에 의해 표시 된 세균 현 탁 액을 흡입 하는 마우스를 발생할 것입니다. - 경우는 inoculum까지 배치 되지 않습니다 다시 충분히 정상적인 호흡, 입과는 inoculum의 후속 흡입을 통해 반사 포부를 집게는 네어스 꼬집어.
- 접종, 후 혀, 서 스 펜 션 문자열에서 마우스를 제거, 감 금 소에 놓고 모니터링 단계 2.1에서 마 취에서 깨어났을 때까지.
4. 질병의 진행을 모니터링
참고: 때문에 동물의 고통을, 다양 한 지표 사용 해야 쥐 죽어가는; 될 때를 나타내는 이전 승인된 IACUC 프로토콜;에 따라이 결정에 따라 안락사를 수행 한다 체온, 체중 감소, 모양, 걸음 걸이, 및 혈액 (예를 들어, iSTAT 통해)9,10,11,12,에서에서 얻을 수 있는 다른 생체를 포함 하는 moribundity의 다양 한 마커 13,14,,1516.
- 이전 승인된 IACUC 프로토콜 (예를들면, CO2 뒤에 자 궁 경부 전위)에 따라 마우스를 안락사
- 기관지, 폐 동맥 및 폐에 가까운 폐 정 맥을 절단 하 여 안락사 마우스에서 폐를 제거 합니다.
- 현미경 검사 법
- 표본 형에서 폐 (또는 부분)를 놓습니다.
- 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물, 완전히 잠수 조직 표본 형을 채우십시오.
- -80 ° c.에 샘플을 동결
- 섹션 및 현미경 검사 법에 대 한 슬라이드에 병리학 실험실에 샘플을 보냅니다.
- 세균성 부담
- 폐 조직 분석 균형에 무게.
- 50 mL 원뿔 유리병 (조직의 크기)에 따라 살 균 PBS의 2 ~ 5 mL를 포함 하는 폐 조직 전송.
- 조직 균질 화기와 폐 조직 균질.
- 약 1000 CFUs/mL, 폐에 있는 예상된 세균성 짐에 따라 달성 하기 위해 살 균 PBS에는 homogenate의 직렬 희석을 수행 합니다.
- 예를 들어 1 × 109 CFUs/mg, 예상 하는 경우 수행 3 1: 100 희석: 9.9 ml PBS의 소용돌이; homogenate의 전송 100 μ 이것은 첫 번째 1: 100 희석 이다. 첫 번째 1: 100 희석의 100 μ 9.9 mL PBS와 소용돌이;의 전송 이것은 두 번째 1: 100 희석 이다. 두 번째 1: 100 희석의 100 μ 9.9 mL PBS와 소용돌이;의 전송 이것은 제 3의 그리고 마지막 1: 100 희석 이다.
- 폐에 있는 세균성 짐을 알 수 없는 경우 예상된 범위를 잡으려고 희석의 범위를 수행 합니다.
- 접시에 살 균 한 dilution(s)입니다.
- Agar (TSA) 격판덮개를 가진 메 마른 Tryptic 간장 국물 (TSB) 준비: 결합 TSB의 30 g, 한 천의 15 g, 물 1 L, 자력으로 혼합 하 고 5 분 쿨을 다음 압력솥에 액체 사이클 15 분을 냉각 허용에 대 한 허용에 대 한 ~ 100 ° C에서 끓는 때까지 열 ~ 55 ° C, 전송 10 mL 갓 압력가 마로 소독 멸 균 페 트리 디쉬에 TSA 실내 온도에 냉각 하 고. 2-5 d 벤치탑에 건조 또는 biosafety 캐비닛 10 분에서 발견 하자.
- 페 트리 접시 살 균 TSA를 포함 하는 희석의 100 μ를 전송 및 TSA 스프레더 또는 유리 비즈를 사용 하 여 분산.
- (즉, 물으로 가득 발견된 1 리터 비 커를 포함 하는 37 ° C 인큐베이터) 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 접시를 저장
- CFUs/mL 폐 homogenate agar 도금에 따라 결정 (예를 들어, 위에서 설명한 제 3의 그리고 마지막 희석의 100 μ 가진 TSA 격판덮개에 100 CFUs 100 CFUs/100 μ × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 것 = 1 × 109 CFUs/mL).
- CFUs/mg 폐 조직 기반 CFUs/mL 폐 homogenate mg 폐 조직/mL homogenate (예를 들어, 위에서 설명한 샘플 사용 폐 조직 PBS, 다음 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg/5 mL = 5 × 107 의 5 mL에 균질의 100 밀리 그램으로 나누어 계산 CFUs/mg).
- 현미경 검사 법
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Representative Results
프로토콜을 따르고 신중 하 게, 재현 하 고 안정적인 데이터를 쉽게 얻을 수 있습니다. 그것은 중요 한 하나의 사용자 지정된 inoculum 준비 프로토콜 하나 서로 비교 하는 실험에 대 한 엄격 하 게 준수입니다. 그것은 또한 감염 절차 동안 마우스를 제대로 처리 하는 것이 중요입니다. 없는 isoflurane 마 취 실로 쥐를 배치 해야 합니다. 마우스는 미리 채워졌다 isoflurane 챔버에 배치 됩니다 경우 당황 것입니다 그리고 아마도 실험 결과 손상 시킬 수 있는 과잉 스트레스를 발생할 수 있습니다. 컨테이너 뚜껑을 확보, 후 천천히 점진적으로 0%에서 4% (v/v), 그것의 농도 증가 하 여 isoflurane를 소개 급하게 isoflurane 관리 또한 공포에 마우스를 발생할 수 있습니다. 쥐 되 면 무 의식, 2-3% (v/v) isoflurane 농도 감소 하 고 몇 분 추가 대 한 챔버에 남아 있을 수 있도록. 이 시점에서, 쥐가 될 준비가 감염 (그림 1).
마 취 약 실에서 마우스를 제거 하 고 혀 (그림 2)에 대 한 액세스를 허용 하도록 그것의 위쪽 앞 니에 의해 중단. 부드럽게 혀 (그림 3) 다음 꺼내 사용 무뚝뚝한 끝난 집게 집게 개최 혀 살 균, gloved 손가락 마우스의 혀에 외상을 방지 하기 위해 (그림 4) 전송. 입 밖에 아직도 혀 oropharynx (그림 5)를 50 µ L inoculum을 전송. 여기, 그것은 매우만 micropipette에 첫 번째 정류장에 pipetting으로 액체를 제공 하는 것이 중요입니다. 두 번째 계속 감염 방해 inoculum에 큰 거품을 발생할 수 있습니다.
감염이 완료 되 면 마우스를 테스트 하기 위한 옵션의 무수 한이 있다. 병 인 연구, 대 한 한 비교할 수 있습니다 감염 된 조직 (그림 6)에 감염 되지 않은. 새로운 치료제의 효과 분석 하는 경우 폐를 제거 하 고 그들이 sectioned 스테인드 수 있습니다 하나. 이것은 한 시간 지점에서 또는 질병의 진행 (그림 7)를 표시 하려면 여러 개의 시간 지점에서 행 해질 수 있다.
또 다른 옵션은 감염 된 쥐의 폐에 세균 부담 평가. 이 다음 조직 균질 화기 (교차 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 rinsing)와 조직 살 균 PBS의 알려진된 볼륨을 포함 하는 유리병에 전송 폐를 제거 하 여 이루어집니다. 영양이 풍부한 agar에 폐 homogenate의 직렬 희석 도금 CFUs/mL 각 폐 homogenate 및 이후 CFUs/mg 폐 조직 (그림 8)에 대 한 계산 수 있습니다. 이, 너무 할 수 있습니다 한 시간 지점에서 또는 질병의 진행을 보여 여러 시간 점에서.
있다 수행 될 수 있는, cytokine 분석 (그림 9), iSTAT (그림 10), cytometry 조사 세포 표면 마커, 프로 파일링, RNAseq, 등 휴대 하 여 패 혈 증 생체를 포함 한 다른 수많은 분석 실험
그림 1 : LD100결정. LD100를 확인 하려면 다양 한 inocula 농도와 쥐를 감염 시킬 필요가 있다. 여기, inoculum 2 × 108 CFUs/마우스 너무 높습니다, 그리고 5 × 107 및 2 × 107 은 너무 낮은, 그리고 1 × 108 은 바로.
그림 2 : 마우스 위쪽 앞 니로 꽉. 쥐 취는 한 마우스 유도 챔버에서 제거 (A) 집게를 사용 하 여 문자열 작업 표면 위에 20-30cm 확보의 루프 밖으로 당겨 (B) 마우스의 위쪽 앞 니, 뒤에 문자열을 이동 (C) 문자열 확인 위쪽 앞 니, 뒤에 보호 그리고 (D) 문자열의 루프에 그것의 위쪽 앞 니에 의해 교수형 마우스를 하자.
그림 3 : Gloved 손가락을 집게 및 전송 그립와 함께 입에서 혀를 당겨. 마우스의 상단 incisors 교수형 후 (A) 집게를 사용 하 여 마우스의 혀를 부드럽게 잡고 (B) 부드럽게 혀, (꺼내C) 신중 하 게 마우스의 외상을 방지 하기 위해 gloved 손가락 집게에서 혀를 전송 혀, 및 (D) gloved 손가락 장소에 혀를 잡아. 혀 입에 다시 미 끄 러에서 방지 하기 위해 충분 한 압력을 적용 해야 하지만 그리 많은 압력 그 외상 ensues. 혀는 나 방 밖에 micropipette 액세스 다음 단계에 대 한 수 있도록 측면을 개최 한다. 이 시점에서, 마우스에 대 한 준비입니다.
그림 4 : 마우스 감염. 입 밖으로 혀, 유지 하는 oropharynx에 50 µ L inoculum을 전송 하는 micropipette를 사용 합니다. 혀 뒷면 입 안으로 피펫으로 팁 놓고 micropipette;에 첫 번째 상단에 갈 세균 현 탁 액 분배 이 완전 한 포부를 방해할 수 있는 inoculum에 큰 거품을 소개 수로 두 번째를 이동 하지 마십시오.
그림 5 : 건강 (감염 되지 않은) 대의 현미경 사진 감염 폐 조직. 되며 고 오신 (H & E) A. baumannii,이 일반적으로 1-3 일 이내에 그 결과 인공 호흡기 관련 폐 렴 (VAP)의 경로 oropharyngeal 포부 전후 폐 섹션의 얼룩과 상당한 치경 여기 볼 염증.
그림 6 : 세균 부담 평가; 증 쇄 및 권한14 수정 . 쥐, 감염 후 해당 IACUC 프로토콜에 따라 성공적인 안락사를 따라 절 개 하 여 폐를 제거 합니다. 폐 조직 덩어리를 수집, 살 균 PBS의 알려진된 볼륨 (2-5 mL)을 포함 하는 유리병에 전송 다음 조직 균질 화기와 균질. 에탄올 및 교차 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 살 균 PBS 균질 화기를 씻어 해야 합니다. 폐 homogenate의 직렬 희석을 수행 하 고 영양이 풍부한 agar에 다양 한 희석 접시 선택한 병원 체에 대 한 적절 하 게 품 어. CFUs/플레이트 × 희석에 따라 각 폐 homogenate에 대 한 CFUs/mL를 계산 하 고 mg 폐 조직/mL 폐 homogenate에 의해 나눕니다. 이것은 한 시간 지점에서 또는 질병의 진행을 보여 여러 시간 지점에서 행 해질 수 있다. 중앙값은 interquartile 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 표시 됩니다. p < 0.05 처리 대 치료 그룹.
그림 7 : 현미경 사진 감염 된 폐 조직의 치료 치료; 증 쇄 및 수정 권한14 대 . 쥐, 감염 후 해당 IACUC 프로토콜에 따라 성공적인 안락사를 따라 절 개 하 여 폐를 제거 합니다. 적절 하 게 보존 조직 (예:, 최적의 절삭 온도 젤에 고-80 ° C에서 냉동) 단면화 및 얼룩에 대 한 병 리 실험실 또는 다른 실력 개인 보낼. 이것은 한 시간 지점에서 또는 질병의 진행을 보여 여러 시간 지점에서 행 해질 수 있다.
그림 8 : Cytokine 분석; 증 쇄 하 고 권한14 수정 . 순환 cytokines를 분석 하려면 (예를 들면, 꼬리 nicking 통해 50 µ L) 충분 한 혈액을 조달, 실내 온도 4 ° C에서 10 분 1000 × g에서 원심 분리기에서 30 분 동안 응고 혈 청 표면에 뜨는 수집을 허용 합니다. 혈 청 Luminex 멀티플렉스 cytokines에 의해 다음 분석할 수 있습니다. 이것은 한 시간 지점에서 또는 질병의 진행을 보여 여러 시간 지점에서 행 해질 수 있다. 중앙값은 interquartile 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 표시 됩니다. p < 0.05 치료 대 치료 그룹에서 동일한 시간 포인트.
그림 9 : 패 혈 증 생체, 재발급 및와 수정 권한을14 . 패 혈 증 생체 분석, 75 µ L의 혈액 (예를 들면, 꼬리 nicking 통해)을 조달 하 고 신속 하 게 원하는 analytes에 대 한 테스트는 iSTAT 카트리지를 전송. 이것은 한 시간 지점에서 또는 질병의 진행을 보여 여러 시간 지점에서 행 해질 수 있다. 중앙값은 interquartile 범위를 나타내는 오차 막대와 함께 표시 됩니다. p < 0.05 치료 대 치료 그룹에서 동일한 시간 포인트.
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Discussion
확실히, 마우스 미니어처 인간 되지 않습니다. 마우스 모델에서 얻은 결과 맥락에서 고려 하 고 이후 차이6두 종 사이의 유사성에 따라 인 간에 게 적용에 대 한 해석 해야 합니다. 그것은 또한 선택으로 적절 한 마우스 긴장 하는 것이 중요 특정 있다; 다른 사람 보다 일부 감염에 더 취약 선택16의 병원 체 변형 마찬가지 다.
엄격한 고 매우 재현 방법으로 감염을 수행 하기 위해 필수적 이다. Inocula는 하나의 값에 아직 그 값의 90%도 무해 한 쥐에 치명적 될 수 있습니다. 따라서, 그것은 절대적는 inoculum을 준비할 때에 특히 그리고 감염 하는 경우이 프로토콜에 나열 된 모든 조건 정확히 같은 방식으로 재생 된다. 또한, 각 병원 체 질병에 독특한 inoculum 일으킬 것입니다. 따라서, 그것은 각 스트레인의 병원 체와 마우스의 각 변형에 대 한 적절 한 inoculum을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 데 필요한.
그램 음성 박테리아, ≤ 5 × 108 CFUs/마우스의 inoculum 악성 긴장에 죽음을 일으키는 원인이 되기 위하여 충분 하다. 그것은 그들은 모호한 관련성 폐16에 배치 되 고 재료의 투명 한 수량에 따라 병 인을 제안 하기 때문에 비-치명적인 ≤1 × 109 CFUs/마우스에는 종자를 사용 하지 않는 좋습니다.
다른 사람에 비해, 거기 oropharyngeal 포부 폐 염 모델에 대 한 아주 몇몇 기술적인 합병증 이며 재현성은 훨씬 더 큰. 50 µ L inoculum 주위 표면 장력은 oropharynx에 배치 하 여 모델 결과의 하나의 사소한 합병증 비 강 호흡 감염의 포부는 원인을 제외 할 수 있습니다. 이 경우에, 전염 성 폐 렴을 유발 하 고 입은 inoculum의 후속 흡입 통해 재귀 포부 다니는 단순히 집게와는 네어스 곤란. 그러나 이것은,, 최소한의 연습으로 쉽게 피할 기술자 기술 오류입니다.
인간의 질병에 그것의 관련성 측면에서 그람 음성 세균 감염의 다른 모델 처럼이 모델의 한 한계는 질병의 진행 속도 이다. 인간은 거의 쥐 질병에 너무 빠르게 진행 하는 이유는 세균 정지의 큰 bolus로 감염 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 모든 FDA 승인 치료 인간에서 임상 실험 이동 하기 전에 그들의 치료 잠재력을 평가 하기 위해 동물 모델에서 같은 변환 연구 검 진을 받 다. 아이러니 하 게도, 모델의 신속성은 또한 매력적인 기능 때문에 그것은 시간의 짧은 기간 내에서 치료 효능에 선명도 제공할 수 있습니다.
아니 murine 모델 완벽 하지만, 이것은 충실 하 게 감염 경로 및 인간 질병의 병 인을 흉내 낸 소설 치료의 급속 한 번역에 대 한 수 있도록 잠재적인 치료제의 효과 평가 하는 기능을 사용 하 여 모델 그는 병원에 필사적으로 필요 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 알레르기의 국가 학회 및 건강의 국가 학회 [부여 번호 R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 그리고 R42 AI106375 학사] 및 미국 식품 및 의약품 안전 청 [계약에서 전염병에 의해 지원 되었다 BML HHSF223201710199C]입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
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