Her presenterer vi en robust metode for å omprogrammere primære embryonale fibroblaster i funksjonelle cardiomyocytes gjennom overuttrykte GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 og miR-133 (GHMT2m) sammen med hemming av TGF-β signalering. Våre protokollen genererer slo cardiomyocytes så tidlig som i 7 dager etter signaltransduksjon med opptil 60% effektivitet.
Trans-differensiering av et somatisk cell type til en annen har enormt potensial modell og behandle menneskelige sykdommer. Tidligere studier har vist at mus embryonale, dermal og kardiale fibroblaster kan omprogrammeres til funksjonelle indusert-cardiomyocyte-lignende celler (iCMs) gjennom overuttrykte kardiogent transkripsjonsfaktorer inkludert GATA4, Hand2, Mef2c, og Tbx5 både i vitro og i vivo. Men har disse tidligere studier vist relativt lav effektivitet. For å gjenopprette hjertefunksjon etter skade, må mekanismer som styrer cardiac omprogrammering bli belyst for å øke effektiviteten og modning av iCMs.
Vi viste tidligere at hemming av pro-fibrotiske signalering dramatisk øker omprogrammering effektivitet. Her detalj vi metoder for å oppnå en reprogramming effektivitet på opptil 60%. I tillegg beskriver vi flere metoder, inkludert flowcytometri, immunofluorescent bilder og kalsium imaging å kvantifisere reprogramming effektivitet og modning av omprogrammeres fibroblaster. Bruker protokollen detaljert her, kan mekanistisk studier foretas å finne positive og negative regulatorer av cardiac omprogrammering. Disse studiene kan identifisere signalveier som kan målrettes for å fremme reprogramming effektivitet og modning, som kan føre til romanen cellen terapi å behandle menneskelige hjerte sykdom.
Iskemisk hjertesykdom er en ledende dødsårsaken i USA1. Ca 800 000 amerikanere opplever en første eller gjennomgående myocardial infarction (MI) per år1. Etter MI, død cardiomyocytes (CMs) og kardiale fibrosis, avsatt av aktivert cardiac fibroblaster, svekke hjertet funksjon2,3. Progresjon av hjertesvikt MI reverseres i stor grad på grunn av dårlig regenerativ antall voksne CMs4,5. Mens gjeldende kliniske behandlinger sakte sykdomsprogresjon og redusere risikoen for fremtidige cardiac hendelser6,7,8,9, reversere ingen terapier sykdomsprogresjon på grunn av manglende evne til å Lag CMs post hjerteinfarkt10. Romanen cell behandling dukker opp for å behandle pasienter etter MI. skuffende, kliniske studier levere stamceller til hjertet etter MI hittil har vist mangelfulle regenerativ potensielle11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Generering av menneske-avledet indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) fra fibroblaster av overuttrykte fire transkripsjonsfaktorer, først vist av Takahashi & Yamanaka, åpnet døren til nye gjennombrudd i cellen terapi19. Disse cellene kan skille ut alle tre bakterie lag19, og flere svært effektive metoder for å generere store antall CMs har tidligere vist20,21. HiPSC-avledet CMs (hiPS-CMs) tilbyr en kraftig plattform for å studere cardiomyogenesis og kan ha viktige implikasjoner for reparasjon hjertet etter skade. Men hiPS-CMs for tiden ansikt translasjonsforskning hekk på grunn av bekymringer teratoma formasjon22, og deres umodne natur kan være pro-arrhythmogenic23. Omprogrammere fibroblaster til hiPSCs skapt interesse i direkte omprogrammering fibroblaster til andre celletyper. Ieda et al. demonstrert at overuttrykte GATA4, Mef2c og Tbx5 (GMT) i fibroblaster fører til direkte omprogrammering til hjerte linje, riktignok på lav effektivitet24. Omprogrammere effektivitet ble forbedret med tillegg av Hand2 (GHMT)25. Siden disse tidlige studiene, har mange publikasjoner vist at endre reprogramming faktor cocktail med ekstra transkripsjon faktorer26,27,28,29, chromatin modifikatorer30,31, microRNAs32,33eller små molekyler34 fører til bedre omprogrammering effektivitet og/eller modning av indusert cardiomyocyte-lignende celler (iCMs ).
Her gir vi en detaljert protokoll for å generere iCMs fra mus embryonale fibroblaster (MEFs) med høy effektivitet. Vi viste tidligere at GHMT cocktail er forbedret med tillegg av miR-1 og miR-133 (GHMT2m) og er ytterligere forbedret når pro-fibrotiske signalnettverk trasé inkludert transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) signalering eller Rho-assosiert protein kinase (ROCK) signalveier er hemmet35. Bruker denne protokollen, viser vi at ca 60% av celler uttrykke cardiac Troponin T (cTnT), ca 50% express α-actinin og et høyt antall juling celler kan observeres så tidlig som i dag 11 etter signaltransduksjon med reprogramming faktorer og behandling med TGF-β type I-reseptor hemmere A-83-01. Videre disse iCMs express gapet krysset proteiner inkludert connexin 43 og utstilling spontan sammentrekning og kalsium transienter. Dette markert forbedring i omprogrammering effektivitet sammenlignet med tidligere studier viser potensial til å regenerere CMs fra endogene celle populasjoner som forblir i etter hjerteinfarkt.
Studien skisserer en høy effektivitet strategi for å omprogrammere direkte fibroblaster i funksjonelle iCMs via levering av GHMT2m omprogrammering faktorene kombinert med undertrykkelse av pro-fibrotiske signalveier. Med flowcytometri, immunofluorescent imaging, kalsium imaging, og slo celletall, vi viser fleste cellene i denne protokollen gjennomgå vellykket omprogrammering og vedta CM avstamning skjebne. Vi har tidligere vist at tillegg av anti-fibrotiske forbindelser inkludert hvilken TGF-β jeg reseptor hemmere A-…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av midler fra Boettcher stiftelsens Webb-Waring biomedisinsk forskningsprogram, American Heart Association forsker Development Grant (13SDG17400031), University of Colorado Institutt for medisin enestående tidlig karriere Forsker Program, University of Colorado divisjon av kardiologi Barlow Nyle legat og NIH R01HL133230 (til KS). A.S.R ble støttet av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 og en pre fellesskap fra University of Colorado konsortiet fibrose Research & oversettelse (CFReT). Denne forskningen ble også støttet av Cancer Center støtte Grant (P30CA046934), hud sykdommer forskning kjerner Grant (P30AR057212) og Flow cytometri kjernen ved University of Colorado Anschutz medisinsk Campus.
C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
bleach | Clorox | ||
50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |