JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Developmental Biology

Undertrykkelse av Pro-fibrotiske signalering Potentiates faktor-mediert omprogrammering av mus embryonale fibroblaster til indusert Cardiomyocytes

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57687
, , , , ,
1Division of Cardiology, Department of Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia,Augusta University

Summary

Her presenterer vi en robust metode for å omprogrammere primære embryonale fibroblaster i funksjonelle cardiomyocytes gjennom overuttrykte GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 og miR-133 (GHMT2m) sammen med hemming av TGF-β signalering. Våre protokollen genererer slo cardiomyocytes så tidlig som i 7 dager etter signaltransduksjon med opptil 60% effektivitet.

Abstract

Trans-differensiering av et somatisk cell type til en annen har enormt potensial modell og behandle menneskelige sykdommer. Tidligere studier har vist at mus embryonale, dermal og kardiale fibroblaster kan omprogrammeres til funksjonelle indusert-cardiomyocyte-lignende celler (iCMs) gjennom overuttrykte kardiogent transkripsjonsfaktorer inkludert GATA4, Hand2, Mef2c, og Tbx5 både i vitro og i vivo. Men har disse tidligere studier vist relativt lav effektivitet. For å gjenopprette hjertefunksjon etter skade, må mekanismer som styrer cardiac omprogrammering bli belyst for å øke effektiviteten og modning av iCMs.

Vi viste tidligere at hemming av pro-fibrotiske signalering dramatisk øker omprogrammering effektivitet. Her detalj vi metoder for å oppnå en reprogramming effektivitet på opptil 60%. I tillegg beskriver vi flere metoder, inkludert flowcytometri, immunofluorescent bilder og kalsium imaging å kvantifisere reprogramming effektivitet og modning av omprogrammeres fibroblaster. Bruker protokollen detaljert her, kan mekanistisk studier foretas å finne positive og negative regulatorer av cardiac omprogrammering. Disse studiene kan identifisere signalveier som kan målrettes for å fremme reprogramming effektivitet og modning, som kan føre til romanen cellen terapi å behandle menneskelige hjerte sykdom.

Introduction

Iskemisk hjertesykdom er en ledende dødsårsaken i USA1. Ca 800 000 amerikanere opplever en første eller gjennomgående myocardial infarction (MI) per år1. Etter MI, død cardiomyocytes (CMs) og kardiale fibrosis, avsatt av aktivert cardiac fibroblaster, svekke hjertet funksjon2,3. Progresjon av hjertesvikt MI reverseres i stor grad på grunn av dårlig regenerativ antall voksne CMs4,5. Mens gjeldende kliniske behandlinger sakte sykdomsprogresjon og redusere risikoen for fremtidige cardiac hendelser6,7,8,9, reversere ingen terapier sykdomsprogresjon på grunn av manglende evne til å Lag CMs post hjerteinfarkt10. Romanen cell behandling dukker opp for å behandle pasienter etter MI. skuffende, kliniske studier levere stamceller til hjertet etter MI hittil har vist mangelfulle regenerativ potensielle11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

Generering av menneske-avledet indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) fra fibroblaster av overuttrykte fire transkripsjonsfaktorer, først vist av Takahashi & Yamanaka, åpnet døren til nye gjennombrudd i cellen terapi19. Disse cellene kan skille ut alle tre bakterie lag19, og flere svært effektive metoder for å generere store antall CMs har tidligere vist20,21. HiPSC-avledet CMs (hiPS-CMs) tilbyr en kraftig plattform for å studere cardiomyogenesis og kan ha viktige implikasjoner for reparasjon hjertet etter skade. Men hiPS-CMs for tiden ansikt translasjonsforskning hekk på grunn av bekymringer teratoma formasjon22, og deres umodne natur kan være pro-arrhythmogenic23. Omprogrammere fibroblaster til hiPSCs skapt interesse i direkte omprogrammering fibroblaster til andre celletyper. Ieda et al. demonstrert at overuttrykte GATA4, Mef2c og Tbx5 (GMT) i fibroblaster fører til direkte omprogrammering til hjerte linje, riktignok på lav effektivitet24. Omprogrammere effektivitet ble forbedret med tillegg av Hand2 (GHMT)25. Siden disse tidlige studiene, har mange publikasjoner vist at endre reprogramming faktor cocktail med ekstra transkripsjon faktorer26,27,28,29, chromatin modifikatorer30,31, microRNAs32,33eller små molekyler34 fører til bedre omprogrammering effektivitet og/eller modning av indusert cardiomyocyte-lignende celler (iCMs ).

Her gir vi en detaljert protokoll for å generere iCMs fra mus embryonale fibroblaster (MEFs) med høy effektivitet. Vi viste tidligere at GHMT cocktail er forbedret med tillegg av miR-1 og miR-133 (GHMT2m) og er ytterligere forbedret når pro-fibrotiske signalnettverk trasé inkludert transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) signalering eller Rho-assosiert protein kinase (ROCK) signalveier er hemmet35. Bruker denne protokollen, viser vi at ca 60% av celler uttrykke cardiac Troponin T (cTnT), ca 50% express α-actinin og et høyt antall juling celler kan observeres så tidlig som i dag 11 etter signaltransduksjon med reprogramming faktorer og behandling med TGF-β type I-reseptor hemmere A-83-01. Videre disse iCMs express gapet krysset proteiner inkludert connexin 43 og utstilling spontan sammentrekning og kalsium transienter. Dette markert forbedring i omprogrammering effektivitet sammenlignet med tidligere studier viser potensial til å regenerere CMs fra endogene celle populasjoner som forblir i etter hjerteinfarkt.

Protocol

Alle eksperimenter krever dyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved UC Denver Anschutz medisinsk Campus. 1. isolering av MEFs Kjøpe C57BL/6 gravid mus på E13. Skip over natten. Euthanize moren etter godkjent IACUC protokoller (ex: ~1.3 L/min CO2 til dyr vises døde etterfulgt av cervical forvridning) Spray mor med 70% etanol og åpne bukhule. Fjern livmor hornet som inneholder embryoer og plasser i en 10 cm parabolen med ste…

Representative Results

Bruker reprogramming strategi skissert ovenfor og figur 1B, generert vi iCMs med ca 70% av celler uttrykke cardiac Troponin T og ca 55% av celler som uttrykker cardiac α-actinin, kvantifisert ved flowcytometri på dag 9 etter Albin på GHMT2m (figur 2A og B). I tillegg fleste cellene express cardiac Troponin T, Troponin jeg cardiac α-actinin samt gapet krysset markøren Connexin 43 dag 14 etter signaltransduksj…

Discussion

Studien skisserer en høy effektivitet strategi for å omprogrammere direkte fibroblaster i funksjonelle iCMs via levering av GHMT2m omprogrammering faktorene kombinert med undertrykkelse av pro-fibrotiske signalveier. Med flowcytometri, immunofluorescent imaging, kalsium imaging, og slo celletall, vi viser fleste cellene i denne protokollen gjennomgå vellykket omprogrammering og vedta CM avstamning skjebne. Vi har tidligere vist at tillegg av anti-fibrotiske forbindelser inkludert hvilken TGF-β jeg reseptor hemmere A-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av midler fra Boettcher stiftelsens Webb-Waring biomedisinsk forskningsprogram, American Heart Association forsker Development Grant (13SDG17400031), University of Colorado Institutt for medisin enestående tidlig karriere Forsker Program, University of Colorado divisjon av kardiologi Barlow Nyle legat og NIH R01HL133230 (til KS). A.S.R ble støttet av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 og en pre fellesskap fra University of Colorado konsortiet fibrose Research & oversettelse (CFReT). Denne forskningen ble også støttet av Cancer Center støtte Grant (P30CA046934), hud sykdommer forskning kjerner Grant (P30AR057212) og Flow cytometri kjernen ved University of Colorado Anschutz medisinsk Campus.

Materials

C57BL/6 Mice Charles River's Laboratory 027 For MEF isolation
Platinum E (PE) Cells Cell Biolabs, INC RV-101 For retrovirus production
DMEM High Glucose Gibco SH30022.FS Component of iCM, PE, and Growth media
Medium 199 Life Technologies 11150-059 Component of iCM media
Fetal Bovine Serum Gemini 100106 Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse Serum Gemini 100508 500 Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50X Life Technologies 11130051 Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100X Life Technologies 11360070 Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X Life Technologies 11140050 Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100X Life Technologies 11120-052 Component of iCM media
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 41400045 Component of iCM media
B27 Gibco 17504-044 Component of iCM media
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) Gibco 35050-061 Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HCl Life Technologies A11139-03 Component of PE media
Puromycin dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200-056 For detaching cells from culture dishes
A-83-01 R&D Systems – Tocris 2939/10 Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSO Thermo Scientific 85190 For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoat Cellutron SC-9035 For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2692 Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 11058-021 Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2c Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFP Plasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268-5G For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) Nalgene  569-0020  For filtering media
Syringes Bd Vacutainer Labware  309654 For viral filtration
0.45 µm Filters Celltreat 229749 For viral filtration
70 µm cell strainers Falcon  352350 For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer  BD 554723 For washing cells for flow cytometry
DPBS 1X Gibco 14190-250 For washing cells
Bovine Serum Albumin VWR 0332-100g For flow cytometry and calcium imaging
Goat Serum Sigma  G9023 For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey Serum Sigma D9663-10mg For blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin T Thermo Scientific ms-295-p 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actinin Sigma A7811L 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43 Sigma  C6219 1:400 IF
Rabbit Troponin I PhosphoSolutions 2010-TNI 1:400 IF
Hoechst Life Technologies 62249 1:10000 IF
Alexa 488, rabbit Life Technologies A-11034 1:800 IF
Alexa 555, mouse Life Technologies A-21422 1:800 IF
Alexa 647, mouse Life Technologies A-31571 1:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer  Bio-RAD For FACS
Paraformaldehyde sigma P6148-500mg For fixing cells for IF
Triton X-100 Promega H5142 For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging System Thermo Scientific AMEFC4300 For IF
NaCl RPI S23020-5000 For calcium imaging
KCl VWR 395 For calcium imaging
CaCl2 Fisher C614-500 For calcium imaging
MgCl2 VWR 97061-352 For calcium imaging
glucose sigma G7528-250g For calcium imaging
HEPES sigma H4034-500g For calcium imaging
Fura-2 AM Life Technologies F1221 For calcium imaging
Fluronic F-127 Sigma P2443-250g For calcium imaging
Nifedipine Sigma N7634-1G For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM
Isoproterenol sigma I6504-1g For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope 3i For calcium imaging
ethanol Decon Laboratories 2801
bleach Clorox
50 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 227261
15 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 188271
15 cm cell culture dishes Falcon 353025
10 cm cell culture dishes Falcon 353003
60 mm cell culture dishes GREINER BIO-ONE 628160
6 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 657160 
12 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 665180 
24 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 662160 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Tags

Pro-fibrotic SignalingFactor-mediated ReprogrammingInduced CardiomyocytesCardiac ReprogrammingFibroblast To Cardiomyocyte ConversionCardiomyocyte GenerationChemic Heart DiseaseFibroblast TransfectionRetrovirus ProductionPlatinum E CellsGHMT2M CocktailMouse Embryonic FibroblastsCollagen Coating
check_url/57687?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Riching, A. S., Zhao, Y., Cao, Y., Londono, P., Xu, H., Song, K. Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (136), e57687, doi:10.3791/57687 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image