Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates
Summary
Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.
Abstract
Trans-bir somatik hücre türü başka bir farklılaşma modellemek ve insan hastalıkları tedavi etmek için büyük potansiyele sahiptir. Önceki çalışmalar göstermiştir bu fare embriyonik, dermal ve kardiyak fibroblastlar fonksiyonel indüklenen-cardiomyocyte-benzeri hücreler (ICMS) reprogrammed kardiyojenik transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere GATA4, Hand2, Mef2c, overexpression ve Tbx5 vitro ve içinde vivo. Ancak, bu önceki çalışmalar nispeten düşük verimlilik göstermiştir. Yaralanma aşağıdaki kalp işlevi geri yüklemek için kalp yeniden programlama yöneten mekanizmaları verimliliği ve olgunlaşma ICMS artırmak için aydınlatılmamıştır gerekir.
Biz daha önce büyük ölçüde pro-fibrotik sinyal inhibisyon programlama verimliliği artar gösterdi. Burada, biz % 60 kadar programlama verimliliğini elde etmek için yöntemleri ayrıntılı olarak. Ayrıca, akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme programlama verimliliği ve programlanmış fibroblastlar olgunlaşma ölçmek için de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Burada ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, mekanik çalışmaları kalp yeniden programlama, pozitif ve negatif düzenleyiciler belirlemek için üstlenilen. Bu çalışmalar programlama verimliliği ve olgunlaşma, roman hücre tedavilere insan kalp hastalığı tedavi etmek için neden olabilir tanıtmak için hedef sinyal yolları tespit edebilir.
Introduction
İskemik kalp hastalığı, Amerika Birleşik Devletleri1ölüm önde gelen nedenidir. Yaklaşık 800.000 Amerikalılar bir ilk veya yineleyen miyokard infarktüsü (mı) başına yıl1deneyim. MI, ölüm cardiomyocytes (CMs) ve kardiyak fibrozis, aktif kardiyak fibroblastlar tarafından tevdi zarar kalp fonksiyonu2,3. Kalp yetmezliği MI takip ilerlemesini büyük ölçüde yetişkin CMs4,5zavallı yeniden üretim kapasitesi nedeniyle edilemez. Geçerli klinik Tedaviler hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak ve gelecekteki kardiyak olaylar6,7,8,9tehlikesini azaltmak iken, hiçbir Tedaviler hastalığın ilerleme yetersizlik nedeniyle ters CMs sonrası infarktüsü10yeniden. Roman hücre tedavileri MI. Disappointingly takip hastaları tedavi etmek için ortaya çıkıyor, klinik kök hücre MI şu ana kadar takip kalp teslim sonuçsuz rejeneratif potansiyel11,12, göstermiştir 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSCs) fibroblastlar tarafından overexpression ilk Takahashi & Yamanaka, tarafından gösterilen dört transkripsiyon faktörlerin nesil hücre terapisi19‘ yeni buluşlar için kapıyı açtı. Bu hücreler tüm üç germ katmanları19ayırt edebilir ve daha önce20,21gösterilen CMs çok sayıda oluşturmak için çeşitli yüksek verimli Yöntemler. CMs (kalça-CMs) HiPSC elde edilen cardiomyogenesis çalışmak için güçlü bir platform sunmaktadır ve yaralanma aşağıdaki kalp onarmak için önemli etkileri olabilir. Ancak, kalça-CMs Şu anda translasyonel Engelli teratoma oluşumu22kaygılar nedeniyle yüz ve olgunlaşmamış doğaları pro-Aritmojenik23olabilir. Fibroblastlar hiPSCs yeniden şekillendirmek için doğrudan fibroblastlar diğer hücre türleri yeniden şekillendirmek için ilgi yol açtı. Ieda ve ark. düşük verimlilik24de olsa bu overexpression GATA4, Mef2c ve Tbx5 (GMT) doğrudan kalp soy, yeniden programlama içinde fibroblastlar sonuçlarında gösterdi. Verimliliği yeniden programlama Hand2 (GHMT)25eklenmesi ile geliştirildi. Beri erken bu çalışmalar, birçok yayın programlama faktörü kokteyl ek transkripsiyon ile değiştirme26,27,28,29faktörler göstermiştir, Kromatin değiştiriciler30,31, mikroRNA32,33veya34 geliştirilmiş yol açan küçük moleküller verimliliği ve/veya indüklenen cardiomyocyte benzeri hücreler (ICMS olgunlaşma yeniden programlama ).
Burada ICMS fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile yüksek verimlilik oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz daha önce kokteyl GHMT miR-1 ve miR-133 (GHMT2m) eklenmesi ile belirgin bir biçimde iyileştirilmiş ve daha fazla artırıldı pro-fibrotik büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştürme de dahil olmak üzere yolları sinyal veya Rho ilişkili gösterdi Inhibe35protein kinaz (ROCK) sinyal yolları vardır. Bu iletişim kuralını kullanan, biz hücreleri yaklaşık % 60’ı kardiyak Troponin T (cTnT) hızlı, yaklaşık % 50 α-Aktinin hızlı ve dayak hücre sayısının yüksek olduğu gün 11 faktörler ve tedavi yeniden programlama, iletim takip erken görülebilir göstermek TGF-β ile ben reseptör inhibitörü A-83-01 yazın. Ayrıca, bu ICMS gap junction proteinler connexin 43 de dahil olmak üzere hızlı ve kendiliğinden kasılma ve kalsiyum geçişler sergilemek. Bu önceki çalışmalara göre verimliliği yeniden programlama düzelme işaretlenmiş CMs kalp sonrası infarktüsü kalır endojen hücre popülasyonlarının üzerinden yeniden oluşturmak için potansiyel gösteriyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu da çalışmanın doğrudan fibroblastlar teslim GHMT2m pro-fibrotik sinyal yolları bastırılması ile kombine faktörlerin yeniden programlama yoluyla fonksiyonel ICMS içine yeniden programlamak için yüksek verimli strateji özetliyor. Kullanarak akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme, görüntüleme ve hücre sayımları, bu protokol için hücreleri çoğunluğu gösterdiğimiz yenerek kalsiyum başarılı yeniden programlama gösterip CM lineage kader. Biz daha önce anti-fibrotik ek maddeler ve bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma fonları programdan Boettcher Vakfı’nın Webb Waring Biyomedikal araştırma, Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe (13SDG17400031), Colorado Üniversitesi Tıp üstün erken kariyer bölümü tarafından desteklenen Akademik Program, University of Colorado bölümü Kardiyoloji Barlow Nyle bağış ve NIH R01HL133230 (KS için). Fibrozis araştırma ve çeviri (CFReT) için A.S.R NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numarası TL1TR001081 ve Colorado Üniversitesi Konsorsiyumu bir önceden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da kanser merkezi destek Grant (P30CA046934), cilt hastalıkları araştırma çekirdek Grant (P30AR057212) ve akış sitometresi özünde Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
