Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti
Summary
Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.
Abstract
Trans-differenziazione di cellule somatiche un tipo in un altro ha un enorme potenziale per modellare e trattare malattie umane. Studi precedenti hanno dimostrato che il mouse embrionali, fibroblasti cutanei e cardiaci possono essere riprogrammati in funzionale indotta-cardiomyocyte-come le cellule (iCMs) tramite sovraespressione di fattori di trascrizione cardiogeno compreso GATA4, Hand2, Mef2c, e TBX5 sia in vitro che in vivo. Tuttavia, questi studi precedenti hanno dimostrato relativamente bassa efficienza. Al fine di ripristinare la funzione del cuore dopo la lesione, meccanismi che governano la riprogrammazione cardiaco devono essere delucidate per aumentare l’efficienza e la maturazione degli iCMs.
Precedentemente abbiamo dimostrato che l’inibizione di segnalazione pro-fibrotici drammaticamente aumenta l’efficienza di riprogrammazione. Qui, abbiamo dettaglio metodi a raggiungere un’efficienza riprogramma fino al 60%. Inoltre, si descrivono diversi metodi tra cui citometria a flusso, formazione immagine immunofluorescente e calcio imaging per quantificare la riprogrammazione l’efficienza e la maturazione dei fibroblasti riprogrammati. Utilizzando il protocollo dettagliato qui, studi meccanicistici possono essere intrapreso per determinare regolatori positivi e negativi della riprogrammazione cardiaco. Questi studi possono identificare vie di segnalazione che possono essere mirate per promuovere l’efficienza riprogrammante e maturazione, che potrebbe portare a cell novel terapie per trattare la malattia di cuore umana.
Introduction
Cardiopatia ischemica è una causa principale di morte negli Stati Uniti1. Circa 800.000 americani esperienza un primo o ricorrente infarto miocardico (MI) per ogni anno1. In seguito MI, la morte dei cardiomiociti (CMs) e fibrosi cardiaca, depositati dai fibroblasti cardiaci attivati, compromettere cuore funzione2,3. Progressione dell’insufficienza cardiaca dopo MI è in gran parte irreversibile a causa la scarsa capacità rigenerativa di adulto CMs4,5. Mentre le terapie cliniche correnti rallentano la progressione di malattia e fare diminuire il rischio di eventi cardiaci futuri6,7,8,9, terapie non invertire la progressione della malattia dovuto l’incapacità di rigenerare il CMs post-infarto10. Terapie cellulari romanzo stanno emergendo per trattare pazienti che seguono MI. sembrto, sperimentazioni cliniche fornire cellule staminali nel cuore seguito finora MI hanno dimostrato inconcludente rigenerativa potenziali11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umano-derivato (hiPSCs) dai fibroblasti da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione, in primo luogo ha dimostrato di Takahashi & Yamanaka, ha aperto la porta a nuovi progressi nella cella terapia19. Queste cellule possono differenziarsi in tutti i tre strati germinativi19, e diversi metodi altamente efficienti per la generazione di un numero elevato di CMs sono stati indicati in precedenza20,21. CMs HiPSC-derivato (fianchi-CMs) offre una potente piattaforma per lo studio cardiomiogenesi e può avere implicazioni importanti per la riparazione del cuore dopo la lesione. Tuttavia, fianchi-CMs attualmente affrontare ostacoli traslazionali dovuto le preoccupazioni di teratoma formazione22, e loro natura immaturo può essere pro-aritmogenica23. Riprogrammazione di fibroblasti in hiPSCs ha suscitato interesse direttamente riprogrammazione fibroblasti in altri tipi cellulari. Ieda et al hanno dimostrato che la sovraespressione di GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) nei risultati di fibroblasti in riprogrammazione diretta per linea cardiaca, anche se a bassa efficienza24. Riprogrammazione di efficienza è stata migliorata con l’aggiunta di Hand2 (GHMT)25. Da questi primi studi, molte pubblicazioni hanno dimostrato che alterando il cocktail fattore riprogrammazione con trascrizione ulteriori fattori26,27,28,29, cromatina modificatori30,31, microRNA32,33o piccole molecole34 conduce ad una migliore riprogrammazione efficienza e/o maturazione indotta del cardiomyocyte-come delle cellule (iCMs ).
Qui forniamo un protocollo dettagliato per generare iCMs da fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) con alta efficienza. Precedentemente abbiamo indicato che il GHMT cocktail è notevolmente migliorata con l’aggiunta di miR-1 e miR-133 (GHMT2m) ed è stata ulteriormente migliorata quando vie tra cui trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) di segnalazione pro-fibrotici o Rho-associati vie di segnalazione della proteina chinasi (ROCK) sono inibiti35. Usando questo protocollo, ci mostrano che circa il 60% delle cellule express cardiaco troponina T (cTnT), circa il 50% express α-actinina, e un elevato numero di celle di battitura può essere osservato più presto il giorno 11 dopo trasduzione di riprogrammazione fattori e trattamento con il TGF-β tipo inibitore del recettore A-83-01. Inoltre, questi iCMs esprimono proteine di giunzione divario tra cui connexin 43 ed esibiscono contrazione spontanea e transitori di calcio. Questo netto miglioramento nella riprogrammazione efficienza rispetto agli studi precedenti dimostra il potenziale per rigenerare CMs da popolazioni di cellule endogene che rimangono post-nell’infarto cuore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente studio delinea una strategia ad alto rendimento per riprogrammare direttamente fibroblasti in iCMs funzionale tramite consegna di GHMT2m riprogrammazione fattori combinati con soppressione delle vie di segnalazione pro-fibrotici. Mediante citometria a flusso, imaging immunofluorescenti, calcio imaging e battendo i conteggi delle cellule, mostriamo la maggior parte delle cellule in questo protocollo subiscono successo riprogrammazione e adottare il destino del lignaggio di CM. Precedentemente abbiamo indicato …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi da programma della Fondazione Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scienziato Development Grant (13SDG17400031), Università del Colorado, dipartimento di medicina eccezionale carriera iniziale Programma di studioso, Università del Colorado divisione di cardiologia Barlow Nyle endowment e NIH R01HL133230 (di k. s). ASR è stata sostenuta da NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numero TL1TR001081 e una borsa di studio pre-dottorato del Consorzio di Università del Colorado per fibrosi ricerca e traduzione (CFReT). Questa ricerca è stata sostenuta anche dal cancro centro supporto Grant (P30CA046934), la pelle malattie ricerca Core Grant (P30AR057212) e il nucleo di citometria a flusso presso l’Università del Colorado, Anschutz Medical Campus.
Materials
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
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