الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة
Summary
والهدف من هذا البروتوكول الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية المعزولة من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). ويشمل هذا البروتوكول إعداد فلاش تجميد عينات من الأنسجة المعوية البشرية، كريوسيكتيونينج، وتلطيخ ethanolic والجفاف، LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
والغرض من هذا الأسلوب الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية التي جمعت من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). وقد حددنا خمس خطوات في سير العمل التي لا بد منها للحصول على عزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي مع كمية ونوعية عالية بما فيه الكفاية لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، عند إعداد الأنسجة المعوية، يجب أن يكون كل عينة السائل الزائد كل إزالة بواسطة النشاف قبل التسوية serosa قدر الإمكان عبر الجزء السفلي من قوالب قاعدة كبيرة. العينات ثم تجمد بسرعة فوق ملاط الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني. وثانيا، عند تقطيع الأنسجة، من المهم أن موضع كريومولدس حتى الأجزاء المعوية موازية للطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك، مما تسفر عن مساحة أكبر من ganglia المعوي كل شريحة. الثالثة، خلال LCM، البولي إثيلين نابثالاتي (القلم)-عرض الشرائح غشاء أكبر قدر من السرعة والمرونة في تحديد الأشكال غير موحدة من ganglia المعوي عند جمع ganglia المعوي. رابعا، للتصور متميزة من ganglia المعوية داخل الأقسام، نقدم الأصباغ المتوافقة مع الإيثانول، مثل “كريسيل البنفسجي”، ممتازة الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي بالنسبة للأصباغ المائية. أخيرا، لاستخراج الحمض النووي الريبي من العقد تم التقاطها، لاحظنا الفروق بين مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية التي أسفرت عن تفوق الجيش الملكي النيبالي الكمية والنوعية، والقضاء على التلوث بالحمض النووي. الأمثل لهذه العوامل في البروتوكول الحالي إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي النوعية والكمية.
Introduction
ويهدف هذا الأسلوب للحصول على عينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة من ganglia المعوي من الأنسجة المعوية البشرية باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). البروتوكول هو موضح هنا تم الأمثل لتقديم نوعية الجيش الملكي النيبالي وغلة كافية للحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) والمقصود ليتم استخدامها مع الأنسجة المعوية البشرية مستأصل حديثا، غير المثبتة، مجمدة في فلاش.
اضطرابات حركية الجهاز الهضمي والأمعاء الوظيفية يؤثر على واحد من كل أربعة أشخاص في الولايات المتحدة. النظام العصبي المعوي (ENS)، كما يشار إلى الدماغ الثاني1، غالباً في وسط هذه الاضطرابات، كما أنها تلعب دوراً حاسما في التوازن القناة الهضمية وحركية. عموما قيدت التلاعب بحركية القناة الهضمية للاستئصال الجراحي للأنسجة أجانجليونيك/نونكونتراكتيلي، وتعديل النظام الغذائي المزمن، و/أو الأدوية. من المستغرب، يظل الترنسكربيتوم الكامل من ENS الكبار تكون متسلسلة، يحد كثيرا من قدرتنا على تحديد الجزيئات داخل ENS يمكن استهداف فارماسيوتيكالي أو تستخدم في علاجات الخلايا الجذعية.
هناك طرق قليلة نسبيا لعزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوية البشرية. يتطلب النهج الأول، تفكك الخلية2، حضانة ارتفاع درجات الحرارة وأوقات طويلة الحضانة؛ على حد سواء التي من المعروف أن تعزز تدهور الجيش الملكي النيبالي، ويغير2،الترنسكربيتوم3. نهج بديل، LCM، أكثر موثوقية يحافظ الترنسكربيتوم ويحمي سلامة الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت LCM لجمع ganglia من الأنسجة المعوية البشرية مجمدة طازجة4،،من56، هذه النهج يعوقها أما ضعف كمية ونوعية الجيش الملكي النيبالي، وكانت ذات العمالة الكثيفة جداً، أو تحتاج إلى تعديل لتلطيخ أو تقنيات استخراج الحمض النووي الريبي للعمل في أيدينا. بروتوكولات LCM أخرى مصممة للحفاظ على الحمض النووي الريبي التي تم العثور عليها في المنتج LCM أدلة قدمت تحسينات إضافية7،8، ولكن التكيف الضروري عند تطبيقه على عزل ganglia المعوي8، 9-ولهذه الأسباب، قمنا بتطوير بروتوكول أمثل استناداً إلى هذه الموارد أن ينتج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية البشرية، وسير عمل سريع نسبيا، وتنتج نتائج متسقة عبر كبيرة عدد العينات.
في هذه الدراسة، نقدم موجزاً لإجراءات محسنة تسهل عزل الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوي مصدرها الأنسجة المعوية البشرية مستأصل. لدينا أسلوب يتضمن خمسة جوانب هامة. ينبغي أن يتم اقتطاعها عينات الأمعاء البشرية الأولى، مستأصل حديثا، غير المثبتة للحجم، وجميع الرطوبة الزائدة إزالة مع أنسجة مختبرية وسويت بالأرض في قالب قاعدة كبيرة قبل تجميد فلاش قمة الطين من الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني (2 ميغا بايت). وينبغي إعداد المقاطع النسجية، والثانية من الأمعاء للحصول على الطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك على شريحة، الذي يقدم حمولة كبيرة من ganglia المعوي. نجاح هذه الخطوة تعتمد إلى حد كبير على عملية إعداد الأنسجة. ثالثا، يتطلب هيكل نونونيفورم ganglia في ENS استخدام البولي إثيلين نابثالاتي (القلم) غشاء الشرائح6، التي توفر أكبر قدر من السرعة والدقة أثناء عملية LCM. ينبغي استخدام الأصباغ الرابعة، المتوافقة مع الإيثانول، مثل “كريسيل البنفسجي”، للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء تلطيخ ganglia المعوي. آخر، عملية استخراج الحمض النووي الريبي حاسمة بالنسبة لنتيجة ناجحة مع ما يليها الحمض النووي الريبي سعينا لنهج استخراج الحمض النووي الريبي التي تنتج نزاهة الجيش الملكي النيبالي عالية ويزيد الغلة الحمض النووي الريبي عند بدء التشغيل مع مجموعات صغيرة من ganglia المعوي ويزيل التلوث بالحمض النووي ويحتفظ العديد من الحمض النووي الريبي الأنواع ممكن.
أخذت معا، الاستفادة المثلى من هذه العوامل في هذه الدراسة إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي كمية ونوعية. وكانت النتائج متسقة إلى حد كبير بين مجموعة كبيرة من العينات، مما يشير إلى اتساق هذا النهج. علاوة على ذلك، فقد استخدمنا هذه النهج بالتسلسل بنجاح عشرات من عينات الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي. يمكن أيضا تكييف الاستراتيجيات التي أبرزت هنا لأداء LCM للعقد المطلوب أو نويات الطرفية والجهاز العصبي المركزي والحالات الأخرى التي تتطلب عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة على نطاق واسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح هذا الإجراء كفاءة جمع ganglia المعوية عديدة كمصدر استخلاص الحمض النووي الريبي لما يليها الحمض النووي الريبي هنا، نحن قد تسارعت العمليات الواردة في البروتوكولات القائمة مع أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كما كافة الخطوات في هذا الإجراء مترابطة، من المهم أن القضاء على كافة الق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للجهات المانحة وأسرهم الذين جعلوا هذا العمل ممكناً. ونقدر أيضا بمساعدة الموظفين في المعهد الدولي للطب والخدمات تينيسي الجهات المانحة للمساعدة في تنسيق مجموعة من الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة. وأيد هذا العمل المنح المقدمة من “المعاهد الوطنية للصحة”، المعاهد الوطنية للصحة OT2-OD023850 لدعم الإدارة البيئية2 وراتب من المعاهد الوطنية للصحة T32-DK007673 إلى أمز. ونحن ممتنون للموظفين من “الموارد المشتركة علم الأمراض المتعدية فاندربيلت” للوصول إلى صك LCM وإسداء المشورة بشأن إعداد الأنسجة. علم أمراض الأنسجة فاندربيلت الموارد المشتركة معتمد جزئيا من المعاهد الوطنية للصحة منح P30-CA068485-14 و U24-DK059637-13. ونشكر مركز الوصول إلى تكنولوجيا الجينوم في قسم علم الوراثة في “كلية الطب في جامعة واشنطن” للمساعدة في تحليل الجينوم. غتاك معتمد جزئيا بالسرطان NCI مركز دعم المنح #P30 CA91842 إلى مركز السرطان Siteman وتكنولوجيات المعلومات والاتصالات/كتسا #UL1TR002345 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (نكر)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، والمعاهد الوطنية للصحة خارطة الطريق للأبحاث الطبية. هذا المنشور هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الرأي الرسمي لنكر أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
