אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.
Abstract
מטרת שיטה זו היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית שנאסף מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). זיהינו חמישה שלבים בזרימת העבודה כי הם חיוניים להשגת RNA מבודד מן הגרעינים המעית עם כמות ואיכות גבוהה מספיק בשביל RNA-תת סעיף. ראשית, בעת הכנת רקמת המעי, כל מדגם חייב להיות כל נוזל עודף הוסר על-ידי סופג לפני שיטוח serosa ככל האפשר לרוחב החלק התחתון של תבניות הבסיס גדול. דוגמאות ואז מוקפאים במהירות על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane. שנית, בעת חלוקתה הרקמה, חשוב למקם cryomolds כך מעיים מקטעים מקבילים המטוס מלא של מקלעת myenteric, ובכך מניב את פני השטח הגדול ביותר של הגרעינים המעית לכל שקופית. שלישית, במהלך LCM, napthalate פוליאתילן (עט)-ממברנה שקופיות מציעים את המהירות ואת גמישות חלוקה לרמות את הצורות לא אחידה של הגרעינים המעית בעת איסוף הגרעינים המעית הגדול ביותר. רביעית, להמחשת ברורים של הגרעינים המעית בתוך המקטעים, צבעים התואמים לאתנול, כמו Cresyl, ויולט, מציעים מעולה לשימור RNA תקינות ביחס צבעי מימית. בסופו של דבר, על החילוץ של RNA מן הגרעינים בשבי, נצפו הבדלים בין מסחרי ערכות חילוץ RNA הניב סופריור RNA כמות ואיכות, תוך צמצום זיהום ה-DNA. אופטימיזציה של גורמים אלה בפרוטוקול הנוכחי מאיץ את זרימת העבודה במידה רבה ותשואות הגרעינים המעית דגימות עם איכות יוצאת דופן של RNA וכמות.
Introduction
שיטה זו נועדה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה של הגרעינים המעית של רקמה אנושית מעיים באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לספק מספיק תשואות ואיכות RNA RNA רצף (RNA-seq) והוא נועד לשמש עם רקמת המעי האנושי resected טריים, מבולבל, קפואה.
הפרעות תנועתיות מערכת העיכול, במעיים פונקציונלי להשפיע על אחד של כל ארבעה אנשים בארצות הברית. מערכת העצבים המעית (ENS), המכונה גם השני המוח1, לעתים קרובות במרכז בהפרעות אלה, כפי שהיא משחקת תפקיד מכריע בטן הומאוסטזיס, תנועתיות. מניפולציה של תנועתיות המעיים הוגבלה כלל כריתה כירורגית לרקמות aganglionic/noncontractile, שינוי תזונה כרונית ו/או תרופות. באופן מפתיע, transcriptome המלא של התרנגולות למבוגרים נשאר היה לסדרם, במידה רבה הגבלת היכולת שלנו לזהות מולקולות בתוך התרנגולות ניתן לפלח הם או מנוצל טיפולים תאי גזע.
ישנן שיטות מעטים יחסית לבידוד RNA מן הגרעינים המעית אנושי. הגישה הראשונה, דיסוציאציה תא2, דורש טמפרטורות גבוהות דגירה דגירה ארוך פעמים; שניהם אשר ידועים לקדם השפלה RNA ולשנות את2,transcriptome3. גישה חלופית, הפונקציה LCM, יותר אמין משמר את transcriptome ומגן RNA שלמות. אף על פי מספר מחקרים השתמשו LCM כדי לאסוף את הגרעינים מוקפאות רקמת המעי האנושי4,5,6, גישות אלה היו גם הקשו על ידי RNA איכות וכמות המסכן, היו די עתירי עבודה, או צריך שינוי של להכתים או RNA מיצוי טכניקות לעבודה בידיים שלנו. LCM פרוטוקולים אחרים המיועדים לשימור RNA שנמצאו במוצר LCM מדריכים מספק שיפורים נוספים7,8, אבל הסתגלות שהיה נחוץ כאשר חל על הבידוד של הגרעינים המעית8, 9. מסיבות אלו, פיתחנו פרוטוקול ממוטבת בהתבסס על משאבים אלה מניב כמויות ניכרות של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית האנושי, יש זרימת עבודה מהיר יחסית, ולא מייצר תוצאות עקביות לרוחב גדול מספר דוגמאות.
במחקר זה, אנו מציגים תקציר של תהליכי אופטימיזציה המאפשרים את הבידוד של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית הטרייה resected. מרקמות מעיים. השיטה שלנו משלבת חמישה היבטים חשובים. הראשון, resected טריים, מבולבל דגימות מעיים אנושיים צריך חיתוך לפי מידה, יש לחות עודפת כל מוסרים עם טישו מעבדה, משוטחים על תבנית הבסיס גדול לפני פלאש-ההקפאה על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane (2 MB). שנית, היסטולוגית מקטעים של המעי צריכים להיות מוכנים לקבל את המטוס מלא של מקלעת myenteric בשקופית, אשר מציעה מטען רב של הגרעינים המעית. ההצלחה עם שלב זה היא תלויה במידה רבה על תהליך הכנת הרקמה. שלישית, המבנה לא אחידה של גרעיני ב התרנגולות מחייב שימוש פוליאתילן napthalate (עט) ממברנה שקופיות6, אשר מציעים את מהירות ודיוק הגדול ביותר במהלך תהליך LCM. צבעי הרביעי, אתנול תואמת, כגון Cresyl, ויולט, אמור לשמש כדי לשמר את שלמות RNA בזמן צביעת המעית הגרעינים. . האחרון, תהליך החילוץ RNA הוא קריטי עבור תוצאות מוצלחות עם ה-RNA-תת סעיף. חיפשנו גישה החילוץ RNA אשר מייצרת שלמות RNA גבוה, הגדלת התשואות RNA כאשר החל אוספים קטנים של הגרעינים המעית, מבטלת את ה-DNA זיהום ו שומר על מינים RNA רבים ככל האפשר.
יחדיו, אופטימיזציה של גורמים אלה במחקר הנוכחי במידה רבה מאיץ את זרימת העבודה ותשואות דגימות של הגרעינים המעית עם דופן RNA בכמות ובאיכות. התוצאות היו עקביות במידה רבה בקרב קבוצה גדול למדי של דגימות, המציין את העקביות של גישה זו. יתר על כן, השתמשנו גישות אלה כדי בהצלחה רצף של RNA דגימות מן הגרעינים המעית עשרות. האסטרטגיות מודגש כאן ניתן גם בהרחבה להתאים לביצוע LCM של הגרעינים הרצוי או גרעינים של ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית במקרים אחרים הדורשים את הבידוד של RNA באיכות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך זה מאפשר את האוסף יעיל של הגרעינים המעית רבים כמקור להפקת RNA עבור ה-RNA-תת סעיף. כאן, אנחנו האיץ את התהליכים המתוארים הפרוטוקולים הקיימים תוך שמירה מקסימאלית RNA שלמות. כמו כל השלבים בהליך זה תלויות זו בזו, זה חשוב כי כל הבעיות ניתן לסלק מן תחילת המחקר, כי כל דוגמאות מוכנות באופן דומה כמו אח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה על התורמים ובני משפחותיהם אשר אפשרו את העבודה הזאת אנחנו מעריכים גם הסיוע של צוות המכון הבינלאומי לרפואה, טנסי סיפורים אישיים שעזרת אוסף קואורדינטות של רקמות השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים, NIH OT2-OD023850 לתמיכה2 וקצבה EMS של NIH T32-DK007673 כדי AMZ. אנחנו מודים לצוות של משאב משותף פתולוגיה ואנדרבילט Translational גישה לכלי LCM, ייעוץ על הכנת הרקמה. ואנדרבילט רקמות פתולוגיה משותפים המשאב נתמך בחלקה על ידי NIH מענקים P30-CA068485-14 ו- U24-DK059637-13. אנו מודים המרכז גישה הגנום טכנולוגיה במחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על העזרה עם אנליזה גנומית. GTAC היא נתמכת באופן חלקי על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט #P30 CA91842 כדי Siteman מרכז הסרטן ועל ידי ICTS/CTSA #UL1TR002345 מענק של המרכז הארצי עבור מחקר משאבים (NCRR), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), וכן NIH מפת הדרכים למחקר רפואי. פרסום זה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את התצוגה הרשמי של NCRR או NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
