डेटाबेस निर्देशित प्रवाह-अस्थि मज्जा माइलॉयड कोशिका परिपक्वता के मूल्यांकन के लिए cytometry
Summary
MDS निदान रूपात्मक मापदंड या गैर-जानकारीपूर्ण cytogenetics के अभाव में कठिन है । MFC MDS निदान प्रक्रिया को परिष्कृत करने में मदद कर सका । नैदानिक अभ्यास के लिए उपयोगी बनने के लिए, MFC विश्लेषण पर्याप्त विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ पैरामीटर्स पर आधारित होना चाहिए, और डेटा विभिन्न ऑपरेटर्स के बीच reproducible होना चाहिए ।
Abstract
फ्रांस में माइलॉयड रोग निदान के लिए multiparameter फ्लो Cytometry (MFC) के आवेदन के अनुरूप करने के लिए फ्रेंच Cytometry एसोसिएशन (एएफसी) के भीतर शुरू किए गए एक कार्यदल का समूह विकसित किया गया था । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पर सहमति हुई थी और सितंबर २०१३ और छह फ्रांसीसी नैदानिक प्रयोगशालाओं में २०१५ नवंबर के बीच लागू किया गया (संत के विश्वविद्यालय अस्पतालों-एटीन, ग्रेनोबल, Clermont-Ferrand, अच्छा है, और लील और Institut पाओली-Calmettes में मार्सैय) और अस्थि मज्जा नमूना तैयारी और डेटा अधिग्रहण के मानकीकरण की अनुमति दी । तीन परिपक्वता डेटाबेस न्युट्रोफिल, monocytic, और अस्थि मज्जा के साथ erythroid वंश “से स्वस्थ” दाता व्यक्तियों (व्यक्तियों के लिए विकसित किए गए एक टेम रोग के किसी भी सबूत के बिना) । प्रत्येक माइलॉयड वंश के लिए विश्लेषण का एक मजबूत तरीका दिनचर्या नैदानिक उपयोग के लिए लागू किया जाना चाहिए । नए मामलों में एक ही तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है और सामांय डेटाबेस के खिलाफ तुलना में । इस प्रकार, मात्रात्मक और गुणात्मक phenotypic विषमताओं की पहचान की जा सकती है और सामान्य अस्थि मज्जा के नमूनों के डेटा के साथ तुलना में 2SD ऊपर उन विकृति का संकेत माना जाना चाहिए. प्रमुख सीमा डेटा के बीच उच्च परिवर्तनशीलता है hybridoma प्रौद्योगिकियों पर आधारित तरीकों के साथ प्राप्त मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर प्राप्त की और वर्तमान में नैदानिक निदान में इस्तेमाल किया । प्राप्त किए गए डेटा की तकनीकी मांयता के लिए मापदंड सेट कर सकता है मदद MFC निदान के लिए की सुविधा में सुधार । इन मानदंडों की स्थापना के लिए एक डेटाबेस के खिलाफ विश्लेषण की आवश्यकता है । डेटा विश्लेषण में जांचकर्ता मनोवाद की कमी इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ है ।
Introduction
phenotypic मार्करों के अभाव में dysplastic माइलॉयड कोशिकाओं में होने वाले परिवर्तन के लिए विशिष्ट MDS दीक्षा और प्रगति, एक नया दृष्टिकोण हाल के वर्षों में परिपक्वता रास्ते के मूल्यांकन के आधार पर प्रस्तावित किया गया है (की अभिव्यक्ति बदल माइलॉयड एंटीजन परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं के उत्पादन के दौरान) या अस्थि मज्जा (बीएम) सेल डिब्बों के भीतर अलग सेल प्रकार के असामान्य वितरण की1,2.
यह लेख myelodysplastic सिंड्रोम (MDS) या अन्य माइलॉयड रक्त रोगों से संबंधित बीएम माइलॉयड सेल डिब्बों में dysplastic परिवर्तन का पता लगाने के लिए MFC के मानकीकृत आवेदन के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करता है । यह अध्ययन MFC डेटा विश्लेषण के लिए परिपक्वता डेटाबेस का उपयोग करने की उपयोगिता भी दिखाता है ।
नमूना तैयारी प्रक्रिया का मानकीकरण, डेटा अधिग्रहण, और विश्लेषण डेटाबेस का उपयोग सबसे अधिक प्रासंगिक phenotypic असामान्यताओं की पहचान बीएम माइलॉयड कोशिकाओं में dysplastic परिवर्तन करने के लिए संबंधित की अनुमति होगी । इसलिए, सांख्यिकीय रूप से चयनित उपसमुच्चय अच्छी तरह से लेबल और सुपरिचित स्वरूपों पर आधारित है (स्वचालित जनसंख्या विभाजक (एपीएस) आरेख, हिस्टोग्राम और डॉट भूखंड) एक विश्लेषण कार्यनीति विकसित करने के लिए आवश्यक हैं, जिसका अनुवर्ती विश्लेषण में उपयोग किया जा सकता है दौर. MDS में मजबूत phenotypic विषमताओं की खोज के साथ या न्यूनतम रूपात्मक dysplasia और बिना सितोगेनिक क aberrancies के मामलों में निदान कम हो जाएगा । immunophenotypic पैनलों की कमी के लिए अनुमति भेदभावपूर्ण मापदंडों की पहचान वर्तमान स्कोर को सरल कर सकते हैं2, नैदानिक विकृति प्रयोगशालाओं में अपने प्रयोज्यता की अनुमति.
यह विधि cytometry डेटा के व्यक्तिपरक व्याख्याओं सीमा, के रूप में MDS निदान3में संकेत दिया गया है । यह चरण संसाधन और विश्लेषण प्रवाह डेटा4के लिए स्वचालित उपकरण के विकास के लिए एक पूर्वावश्यकता है ।
mds क्लोनल टेम स्टेम सेल (HSC) विकारों जिसमें spliceosome उत्परिवर्तनों विशिष्ट epigenetic संशोधक के साथ सहयोग करने के लिए mds phenotype उपज का एक विषम समूह शामिल हैं । अब यह ज्ञात है कि, HSC उत्परिवर्तनों के साथ, अंय तंत्र ऐसे ंयायपालिका प्रतिरक्षा मध्यस्थता सूजन और घातक HSCs और बीएम के stromal microenvironment के बीच बातचीत के रूप में MDS pathophysiology, में शामिल हैं । हालांकि, इन तंत्र खराब समझ में रहते हैं । MDS के व्यापक नैदानिक और जैविक विविधता निदान और इष्टतम चिकित्सा एक चुनौती का चयन करता है । पिछले दशक में, कई अध्ययनों से पता चला है कि MFC अक्सर dysplasia आकृति विज्ञान की तुलना में2 का पता लगाने में अधिक संवेदनशील है, लेकिन तकनीकी और आर्थिक बाधाओं इस तकनीक को मानकीकरण मुश्किल बनाने के लिए, परिणाम के साथ अक्सर पर निर्भर करता है दुभाषिया3का अनुभव । इसके अलावा, यह कैसे MFC के साथ या न्यूनतम रूपात्मक dysplasia के बिना और सितोगेनिक क विसंगतियों के अभाव में मामलों में mds की ओर संतुलन टिप कर सकते हैं स्पष्ट नहीं है, या hypocellular MDS जैसे मामलों की सीमा रेखा में, एक कम विस्फोट गिनती के साथ, अन्य गैर-क्लोनर बीएम से ऐसे अस्थि मज्जा विफलता के रूप में विकारों (यानी, अप्लास्टिक एनीमिया). यह भी गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) से विस्फोटों की एक अतिरिक्त के साथ MDS के मामलों की सीमा रेखा अंतर करने के लिए मुश्किल रहता है । इन सभी कारणों के लिए, नैदानिक दिशानिर्देशों MFC परीक्षण MDS अंतिम निदान में एकीकृत नहीं है । २०११ में, अमेरिका के राष्ट्रीय व्यापक कैंसर नेटवर्क (NCCN) CD34 के प्रतिशत के अनुमान के लिए MFC की सिफारिश की + कोशिकाओं, कंपकंपी स्वप्नदोष hemoglobinuria क्लोन का पता लगाने, और साइटोटोक्सिक में hypocellular टी-सेल क्लोनों की उपस्थिति5MDS । इन दो बाद स्थितियों को भी एक चिकित्सकीय लक्ष्य शामिल है क्योंकि नैदानिक डेटा immunosuppressive चिकित्सा के लिए इन रोगियों की एक अच्छी प्रतिक्रिया दिखाई है6। २०१७ NCCN दिशानिर्देश, अंतर्राष्ट्रीय कार्य समूह (IWG) सिफारिशों का हवाला देते हुए, MDS निदान के लिए सह-मापदंड के बीच MFC द्वारा ंयायपालिका immunophenotyping डिटेक्शन सूचीबद्ध, लेकिन कोई भी विनिर्देशों बनाने के बिना6. इसके अलावा, हाल ही में प्रकाशित जो वर्गीकरण निर्धारित कि MFC निष्कर्षों अकेले निर्णायक रूपात्मक और/या सितोगेनिक क डेटा7के अभाव में MDS के एक प्राथमिक निदान स्थापित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं । फिर भी, MFC एक अतिरिक्त माइलॉयड कोशिका परिपक्वता पैटर्न के dysregulation दिखा परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और रोग पाठ्यक्रम में एक विशिष्ट समय पर एक रोगी के लिए “सामांय से दूरी” बढ़ाता है ।
यह विधि dysplasia के मूल्यांकन में बीएम माइलॉयड कोशिकाओं में रुचि MFC immunophenotyping का उपयोग कर, क्रम में dysplastic विषमताओं के साथ MDS या अन्य माइलॉयड विकारों में निदान को परिष्कृत करने के इच्छुक नैदानिक प्रयोगशालाओं पर लागू है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बीएम महाप्राण की गुणवत्ता अंतिम परिणाम पर प्रभाव सकता है । बीएम महाप्राण के hemodilution progenitors या पूर्ववर्ती कोशिकाओं के अभाव के कारण परिपक्वता के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के वितरण को विकृत कर सकता है । शायद …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी BD के द्वारा प्रदान किया गया । लेखक अपने सहयोगी, डॉ पास्कल Flandrin-Gresta, आणविक जीवविज्ञान विभाग, रुधिर प्रयोगशाला, संत के विश्वविद्यालय अस्पताल-एटीन, फ्रांस, जो दूसरे के लिए NGS डेटा की व्याख्या के लिए विशेषज्ञता प्रदान की है से धंयवाद करना चाहूंगा MDS मामला । लेखक उनके हित और इस अध्ययन में शामिल करने के लिए और रोगियों और उनके इस अध्ययन में भाग लेने के लिए समझौते के लिए स्वस्थ दाताओं के लिए चिकित्सक hematologists के लिए आभारी हैं । लेखक भी प्रकाशन के लिए वित्तीय सहायता के लिए “लेस आमिष de Rémi” फाउंडेशन का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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