データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため
Summary
MDS の診断は非有益な細胞遺伝学または形態学的条件の不在で難しいです。MFC では、MDS の診断プロセスを改良を助けることができます。臨床練習のために便利になる、MFC 分析が十分な特異性と感度、パラメーターに基づく必要があります、データは異なる事業者間再現する必要があります。
Abstract
フランス語フローサイトメトリー協会 (AFC) 内を開始したワーキング グループは、フランスの骨髄疾患診断のため多項目フローサイトメトリー (MFC) のアプリケーションを調和させるために開発されました。ここで提示されたプロトコルが合意し、2013 年 9 月と 2015 年 11 月の間応用 6 フランス診断所 (サンテティエンヌ、グルノーブル、クレルモン ・ フェラン、ニース、リール、Institut パオリ-Calmettes での大学病院でマルセイユ)、骨髄サンプル準備およびデータ集録の標準化を許可します。3 つの成熟データベースは、好中球、単球と「健康」ドナー個人 (造血疾患の証拠なしの個人) から骨髄で赤芽球系に開発されました。各骨髄系の頑健な解析は日常的診断に該当する必要があります。新しいケースは同じ方法で解析でき、通常のデータベースと比較します。したがって、量的・質的形質異常を識別でき、2SD 通常骨髄のサンプルのデータと比較して上記の病理を示す考慮すべき。主な制限は、ハイブリドーマ技術に基づいて、現在臨床診断に使用方法で得られたモノクローナル抗体を使用して達成データ間の高い変動です。取得したデータの技術的な検証に関する条件を設定 MDS の診断のための MFC のユーティリティを向上させるを助けるかもしれない。これらの基準の確立には、データベースに対して分析が必要です。データ分析で調査官の主観の削減は、この方法の重要な利点です。
Introduction
近年成熟経路 (の発現の変化の評価に基づく MDS の開始そして進行の間に骨髄系細胞で発生する異形成の変更を特定の表現型マーカーがない場合は、新しいアプローチを提案されています。成熟した骨髄系細胞の生産の間に骨髄性抗原) や骨髄 (BM) 内の別のセル型の異常分布の細胞コンパートメント1,2。
骨髄異形成症候群 (MDS) やその他の骨髄性血液疾患に関連する BM 骨髄球系細胞コンパートメントの異形成の変化を検出するために MFC の標準化されたアプリケーションのための新しい手法を提案します。本研究では、MFC データ解析のための成熟のデータベースを使用するユーティリティも示しています。
サンプルの準備の手順、データ集録、およびデータベースを用いた解析の標準化 BM 骨髄細胞の異形成の変化に関連する最も関連性の高い表現型異常の同定できるようになります。したがって、適切な標識が、よく知られている形式 (自動人口区切り記号 (APS) 図、ヒストグラム、およびドット プロット) に基づく統計的に選択したサブセットがその後の分析で使用できる解析戦略を開発するため必要丸めます。MDS の堅牢な表現型異常の発見とせず最小限の形態学的異形成や細胞遺伝学的 aberrancies なしの場合診断も和らぐ。肺浸潤パネルの削減を可能にする差別のパラメーターの同定可能性があります、現在スコア2、臨床病理学研究室で彼らの適用性を許可を簡略化します。
このメソッドは、MDS の診断3で通知されて、フローサイトメトリー データの主観的な解釈を制限します。この手順は、処理・解析の流れデータ4自動化ツールの開発のための前提条件です。
MDS は、スプライソソームの突然変異が MDS 表現型をもたらす特定のエピジェネティックな修飾子と協力して造血幹細胞 (HSC) 無秩序の異質グループで構成されます。それは今、HSC の突然変異と他のメカニズム異常免疫炎症や悪性造血と BM の間質の微小環境の相互作用など、MDS の病態に関与している知られています。しかし、これらのメカニズムは不十分な理解まま。MDS の広い臨床的および生物学的多様性は、挑戦診断と最適な治療法の選択を作る。過去 10 年間で複数の研究を示している MFC はしばしばより多くである異形成2形態、しかし技術的、経済的制約の検出に敏感な多くの場合異なります結果と標準化が困難なこの手法を作る、3通訳の経験。また、わかりにくい方法 MFC ができる他の非クローン BM から MDS に向かってバランス、細胞遺伝学的異常の有無や境界例低爆発カウント hypocellular MDS などの最小限の形態学的異形成の有無の場合での先端骨髄障害など障害 (すなわち。、再生不良性貧血)。それはまた急性骨髄性白血病 (AML) から爆発の過剰な MDS のボーダーラインのケースを区別することは困難に残る。これらのすべての理由から、臨床ガイドラインは MFC の MDS の最終的な診断テストを統合できません。2011 年、米国国立総合がんネットワーク (NCCN) では、CD34 陽性細胞の割合、発作性夜間血色素尿症クローンの検出と hypocellular MDS5の細胞傷害性 T 細胞クローンの存在の推定の MFC をお勧めします。臨床データは、免疫抑制療法6にこれらの患者の良い反応を示されているので、これら 2 つの後者の状況は治療目標も含まれます。国際作業グループ (IWG) 勧告を引用して 2017 の NCCN のガイドラインには、MDS の診断のため、任意の仕様6をすることがなく、共同の条件間で MFC による異常診療検出が一覧表示されます。さらに、最近公開された WHO 分類は MFC 所見だけでは決定的な形態学的・細胞遺伝学的データ7の不在で MDS の第一次診断を確立するのに十分でないことを定めています。ただし、MFC は成熟パターンの骨髄球系細胞の調節不全を示し、患者の病気の経過で特定の時間に通常からの「距離」を定量化追加テストとして使用できます。
このメソッドは、臨床研究所データシートまたは異形成異常とその他の骨髄性疾患の診断を絞り込むために MFC 診療を使用して BM 骨髄細胞の異形成の評価に興味を持って適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
BM 吸引の質が最終的な結果に影響を与えます。BM 吸引の希釈は、前駆細胞の不在のための成熟のさまざまな段階で細胞や前駆体細胞の分布をゆがめる可能性があります。おそらく大量に溶解法を用いた流れのフローサイトメトリーによる解析で希釈の BM 吸引の正規化で助けるかもしれない。また、フローサイトメトリーによる BM 骨髄異形成の評価のための重要なステップはサンプル処理や?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究で使用される抗体は、BD バイオ サイエンスによって提供されました。著者は彼らの同僚から、分子生物学、血液学研究所、大学病院のサンテティエンヌ、フランス、2 番目の NGS データの解釈のための専門知識を提供、Flandrin Gresta パスカル博士を感謝したいです。MDS の場合。著者は、彼らの関心と本研究の介入と患者と本研究に参加するアグリーメントの健康なドナーの臨床血液感謝しています。著者は出版のための金融支援「Les Amis de レミ」財団に感謝によってたいです。
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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