Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo

Summary

La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l’analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.

Abstract

Un gruppo di lavoro avviato entro l’associazione di Cytometry francese (AFC) è stato sviluppato al fine di armonizzare l’applicazione della citometria a flusso multiparametrica (MFC) per la diagnosi di malattia mieloide in Francia. Il protocollo presentato qui è stato concordato e applicata tra settembre 2013 e novembre 2015 in sei laboratori diagnostici francesi (ospedali dell’Università di Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza e Lille e Institut Paoli-Calmettes in Marsiglia) e ha permesso la standardizzazione dell’acquisizione di dati e preparazione del campione del midollo osseo. Tre database di maturazione sono stati sviluppati per neutrofilo, monocytic e stirpi degli eritrociti con midollo osseo da individui “sani” donatore (individui senza alcuna prova di una malattia ematopoietica). Un metodo affidabile di analisi per ogni linea mieloide dovrebbe essere applicabile per uso diagnostico sistematico. Nuovi casi possono essere analizzati nello stesso modo e confrontati con i database di solito. Così, le anomalie fenotipiche quantitative e qualitative possono essere identificate e quelli sopra 2SD rispetto ai dati dei campioni di midollo osseo normale dovrebbe essere considerate indicative di patologia. La maggiore limitazione è la maggiore variabilità tra i dati ottenuti utilizzando gli anticorpi monoclonali ottenuti con i metodi basati su tecnologie di ibridoma e attualmente utilizzati nella diagnosi clinica. L’impostazione di criteri per la validazione tecnica dei dati acquisiti possono contribuire a migliorare l’utilità di MFC per la diagnostica MDS. La definizione di questi criteri richiede analisi in un database. La riduzione della soggettività investigatore nell’analisi dei dati è un importante vantaggio di questo metodo.

Introduction

In assenza di marcatori fenotipici specifici per i cambiamenti dysplastic che si verificano nelle cellule mieloidi durante MDS iniziazione e progressione, un nuovo approccio è stato proposto negli ultimi anni sulla base della valutazione delle vie di maturazione (alterata espressione di gli antigeni mieloidi durante la produzione di cellule mieloidi mature) o della distribuzione anomala di tipi differenti delle cellule all’interno del midollo osseo (BM) delle cellule scomparti^1,2.

Questo articolo presenta un metodo nuovo per applicazione standardizzata di MFC al fine di rilevare i cambiamenti dysplastic in compartimenti delle cellule mieloidi BM correlati a sindromi mielodisplastiche (MDS) o altre malattie ematologiche mieloidi. Questo studio inoltre mostra l’utilità dell’utilizzo di database di maturazione per l’analisi dei dati MFC.

Standardizzazione della procedura di preparazione del campione, acquisizione dati e analisi utilizzando i database consentirebbe l’identificazione delle anomalie fenotipiche più rilevanti legate a cambiamenti dysplastic in cellule mieloidi BM. Pertanto, sono necessari per lo sviluppo di una strategia di analisi che può essere utilizzata in successive analisi statisticamente selezionati sottogruppi basati su formati ben identificati e incontestati (dot grafici, istogrammi e diagrammi separatore automatico di popolazione (APS)) Arrotonda. La scoperta di anomalie fenotipiche robuste in MDS faciliterebbe la diagnosi nei casi con o senza displasia morfologica minima e senza aberrancies citogenetica. Identificazione dei parametri discriminanti consentendo la riduzione di immunophenotypic pannelli può semplificare l’attuale punteggi², permettendo loro applicabilità nei laboratori di patologia clinica.

Questo metodo limita le interpretazioni soggettive dei dati cytometry, come è stato segnalato in MDS diagnosi³. Questo passaggio è un prerequisito per lo sviluppo di strumenti automatizzati per l’elaborazione e l’analisi di flusso dati⁴.

MDS comprende un gruppo eterogeneo di disordini clonali di cellule staminali ematopoietiche (HSC) in cui le mutazioni spliceosoma cooperano con modificatori epigenetici specifici per produrre il fenotipo MDS. È ormai noto che, insieme con le mutazioni di HSC, altri meccanismi sono coinvolti nella fisiopatologia MDS, come aberrante infiammazione immune-mediata e interazioni tra HSCs maligno ed il microambiente stromale del BM. Tuttavia, questi meccanismi rimangono poco compresi. L’eterogeneità larga clinico e biologico di MDS rende la diagnosi e la selezione della terapia ottima di una sfida. Nell’ultimo decennio, gli studi multipli hanno indicato che MFC è spesso più sensibile nel rilevare displasia² rispetto alla morfologia, ma i vincoli tecnici ed economici rendono questa tecnica difficile da standardizzare, con risultati spesso dipende il Esperienza di interprete³. Inoltre, non è chiaro come MFC può pendere la bilancia verso MDS in casi con o senza displasia morfologica minima e in assenza di anomalie citogenetiche o in casi limite come hypocellular MDS, con un conteggio basso blast, da altri non-clonale BM disturbi come guasto del midollo osseo (cioè., anemia aplastica). Inoltre rimane difficile da differenziare i casi limite di MDS con un eccesso di scoppi dalla leucemia mieloide acuta (AML). Per tutti questi motivi, le linee guida cliniche non integrano MFC test nella diagnosi finale di MDS. Nel 2011, US nazionale completa Cancer Network (NCCN) consigliato MFC per la stima della percentuale di cellule CD34 +, rilevamento dei cloni di emoglobinuria parossistica notturna e la presenza di cloni di cellula T citotossici in hypocellular MDS⁵. Queste due situazioni di quest’ultime comportano anche un obiettivo terapeutico poiché dati clinici hanno dimostrato una buona risposta di questi pazienti alla terapia immunosopressiva⁶. Linee guida NCCN 2017, citando le raccomandazioni dell’International Working Group (IWG), elencati aberrante immunophenotyping rilevamento da MFC tra i co-criteri per la diagnosi MDS, ma senza fare alcun specifiche⁶. Inoltre, la classificazione del WHO pubblicata di recente stipula che MFC risultati da soli non sono sufficienti per stabilire una diagnosi primaria di MDS in assenza di dati morfologici e/o citogenetica conclusivi⁷. Tuttavia, MFC può essere utilizzato come un ulteriore test mostrano la disregolazione della cellula mieloide maturazione modelli e quantificare la “distanza dal normale” per un paziente in un momento specifico nel corso della malattia.

Questo metodo è applicabile a laboratori clinici interessati nella valutazione della displasia nelle cellule mieloidi BM usando MFC immunophenotyping, al fine di perfezionare la diagnosi in MDS o altri disordini mieloidi con anomalie dysplastic.

Protocol

Il protocollo elencato di seguito è stato approvato dal “Comité de Protection des Personnes” (comitato etico indipendente) 1 Sud-Est da Università ospedale di Saint-Etienne, Francia. 1. citometro impostazioni Nota: Le impostazioni del citometro sono state eseguite conformemente alle raccomandazioni di flusso di Francia, secondo la procedura di EuroFlow “EuroFlow Standard operativo protocollo (SOP) per la messa in funzione e compensazione (https://www.euroflow.org/u…

Representative Results

I 54 campioni di BM raccolti in K-EDTA anticoagulante sono stati inclusi nello studio. In assenza di tutte le informazioni sui pazienti sono stati analizzati i dati MFC. Studio retrospettivo hanno dimostrato che i campioni di BM erano 7 donatori sani (5 maschi e 2 femmine con un’età mediana di 47,4 [35-48], 11 individui senza prova di una malattia ematopoietica (8 maschi e 3 femmine con un’età mediana di 57,9 [35-72]) e 36 casi con varie condizioni patologiche: 1 caso con l’anemia e il…

Discussion

La qualità dell’aspirato BM poteva avere un impatto sui risultati finali. L’emodiluizione dell’aspirato BM potrebbe distorcere la distribuzione delle cellule in diversi stadi di maturazione a causa dell’assenza dei progenitori o precursori cellule. Probabilmente che impiegano un metodo di lisi di massa può aiutare nella normalizzazione del BM aspira per hemodilution in analisi cytometric di flusso. Inoltre, i passaggi critici per la valutazione di displasia mieloide BM di citometria a flusso sono l’esempio di elaborazi…

Materials

BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µl and 200µl
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain