Database-styrede flowcytometri for evaluering af knoglemarven myeloide celle modning

Summary

MDS diagnose er vanskeligt i mangel af morfologiske kriterier eller ikke-informativ cytogenetisk. MFC kunne bidrage til at forædle MDS diagnostiske proces. For at blive nyttige for klinisk praksis, MFC analysen skal være baseret på parametre med tilstrækkelig specificitet og sensitivitet, og oplysningerne skal være reproducerbare mellem forskellige operatører.

Abstract

En arbejdsgruppe, der er iværksat inden for den franske flowcytometri (AFC) blev udviklet for at harmonisere anvendelsen af multiparameter flowcytometri (MFC) for myeloid sygdom diagnose i Frankrig. Protokollen præsenteres her var aftalt og anvendt mellem September 2013 og November 2015 i seks franske diagnostiske laboratorier (universitetshospitaler i Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, og Lille og Institut Paoli-Calmettes i Marseille) og tilladt standardisering af knoglemarven prøve forberedelse og dataopsamling. Tre modning databaser blev udviklet til neutrofile, monocytic, og erythroid lineages med knoglemarv fra “sund” donor personer (personer uden nogen tegn på en hæmatopoietisk sygdom). En robust metode til analyse af hver myeloide lineage bør gælde for rutinemæssig diagnostisk brug. Nye tilfælde kan analyseres på samme måde og sammenlignet med de sædvanlige databaser. Således, kvantitative og kvalitative fænotypisk abnormiteter kan identificeres og dem over 2SD sammenlignet med data fra normal knoglemarv prøver skal betragtes som vejledende i patologi. Den store begrænsning er den højere variabilitet mellem de data, der opnås ved hjælp af monoklonale antistoffer fremstillet med metoder baseret på hybridom teknologier og i øjeblikket anvendes i kliniske diagnose. Fastsættes kriterier for teknisk validering af de data, der er erhvervet kan hjælpe med at forbedre nytten af MFC til MDS diagnostik. Opstillingen af disse kriterier kræver analyse mod en database. Reduktion af investigator subjektivitet i dataanalyse er en vigtig fordel ved denne metode.

Introduction

I mangel af fænotypiske markører specifikke til de Dysplastiske forandringer i myeloide celler under MDS indledningen og progression, er en ny tilgang blevet foreslået i de seneste år baseret på en evaluering af modning veje (ændret udtryk for myeloid antigener under produktionen af modne myeloide celler) eller af unormale fordelingen af forskellige celletyper i knoglemarven (BM) celle rum^1,2.

Denne artikel præsenterer en ny metode for standardiseret anvendelse af MFC for at afsløre Dysplastiske forandringer i BM myeloide celler rum relateret til myelodysplastisk syndrom (MDS) eller andre myeloide hematological sygdomme. Denne undersøgelse viser også nytten af benytter modning databaser for MFC dataanalyse.

Standardisering af eksempelprocedure forberedelse, dataopsamling og analyse ved hjælp af databaserne, der ville tillade identifikation af de mest relevante fænotypisk abnormiteter relateret til Dysplastiske forandringer i BM myeloide celler. Derfor, statistisk valgte delmængder baseret på godt mærket og velkendt formater (automatiske befolkning Separator (APS) diagrammer, histogrammer og dot parceller) er påkrævet for at udvikle en analyse-strategi, der kan bruges i efterfølgende analyse runder. Opdagelsen af robust fænotypisk abnormiteter i MDS ville lette diagnosen i tilfælde med eller uden minimal morfologiske dysplasi og uden cytogenetisk aberrancies. Identifikation af diskriminerende parametre giver mulighed for reduktion af immunophenotypic paneler kan forenkle de nuværende score², tillader deres anvendelighed i klinisk patologi laboratorier.

Denne metode begrænser de subjektive fortolkninger af flowcytometri data, som har været signaleret i MDS diagnose³. Dette trin er en forudsætning for udviklingen af automatiserede værktøjer til behandling og analyse af flow data⁴.

MDS består af en heterogen gruppe af klonede hæmatopoietisk stamcelle (HSC) lidelser som spliceosome mutationer i samarbejde med specifikke epigenetiske modifikatorer at give MDS fænotype. Det er nu kendt, at sammen med HSC mutationer, andre mekanismer er involveret i MDS Patofysiologi, som afvigende immun-medieret betændelse og interaktioner mellem maligne HSCs og de stromale mikromiljø af BM. Disse mekanismer er dog stadig dårligt forstået. Bredt klinisk og biologiske heterogenitet af MDS gør diagnose og valg af den optimale behandling en udfordring. I det sidste årti, har flere undersøgelser vist, at MFC er ofte mere følsomme til at opdage dysplasi² end morfologi, men tekniske og økonomiske begrænsninger gør denne teknik vanskeligt at standardisere, med resultater ofte afhængig af oplevelse af tolk³. Det er desuden uklart, hvordan MFC kan tippe balancen mod MDS i tilfælde med eller uden minimal morfologiske dysplasi og i mangel af cytogenetiske anomalier, eller i grænsetilfælde som hypocellular MDS, med en lav blast tælle, fra andre ikke-klonede BM lidelser såsom knoglemarv svigt (dvs., Aplastisk anæmi). Det er også fortsat vanskeligt at skelne grænsetilfælde af MDS med et overskud af Blaster fra akut myeloid leukæmi (AML). Af alle disse grunde integrerer de kliniske retningslinjer ikke MFC test i MDS endelige diagnose. I 2011 anbefalede den amerikanske nationale omfattende Cancer Network (NCCN) MFC til at anslå procentdelen af CD34 + celler, påvisning af paroxysmal natlige hemoglobinuria kloner, og tilstedeværelsen af cytotoksiske T-celler kloner i hypocellular MDS⁵. Disse to sidstnævnte situationer også indebære en terapeutiske mål for kliniske data har vist en god respons på disse patienter til immunsupprimerende behandling⁶. 2017 NCCN retningslinjer, med henvisning til de internationale arbejder gruppen (Kuwait) anbefalinger, opført afvigende Immunofænotypning påvisning af MFC blandt fælles kriterier for MDS diagnose, men uden at gøre nogen specifikationer⁶. Desuden, fastsætter den nyligt offentliggjorte WHO klassifikationen at MFC resultater alene ikke er tilstrækkelig til at fastslå en primære diagnose af MDS i mangel af afgørende morfologiske og/eller cytogenetisk data⁷. MFC kan dog bruges som en ekstra test viser dysregulering af myeloide celle modning mønstre og kvantificere “distance fra normal” for en patient på et bestemt tidspunkt i kurset sygdom.

Denne metode finder anvendelse på kliniske laboratorier interesseret i evalueringen af dysplasi i BM myeloide celler ved hjælp af MFC Immunofænotypning, for at finpudse diagnose i MDS eller andre myeloide sygdomme med dysplastiske abnormiteter.

Protocol

Den protokol, der er anført nedenfor er blevet godkendt af den “Comité de Protection des Personnes” (uafhængige etiske komité) Sud-Est 1 fra University Hospital i Saint-Étienne i Frankrig. 1. forskellige indstillinger Bemærk: Indstillingerne for forskellige blev udført efter Frankrig Flow anbefalinger, efter EuroFlow Procedure “EuroFlow Standard Operating protokol (SOP) for Instrument Setup og kompensation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php). <…

Representative Results

54 BM prøverne høstet i K-EDTA antikoagulans indgik i undersøgelsen. MFC data blev analyseret i mangel af oplysninger om patienterne. Retrospektiv undersøgelse viste, at BM stikprøverne var fra 7 raske donorer (5 hanner og 2 hunner med en median alder af 47.4 [35-48], 11 personer med ingen tegn på en hæmatopoietisk sygdom (8 hanner og 3 hunner med en median alder af 57,9 [35-72]) og 36 tilfælde med forskellige patologiske betingelser: 1 kasse med anæmi og lavt kreatinin niveau, …

Discussion

Kvaliteten af BM aspirat kan indvirke på de endelige resultater. Blodfortynding af BM aspirat kan forvrænge fordelingen af celler i forskellige stadier af modning på grund af fravær af stamfaderen eller prækursorer celler. Sandsynligvis ansætte en bulk lysing metode kan hjælpe i normalisering af BM aspirates for blodfortynding i flow cytometric analyser. Derudover er de kritiske trin for evaluering af BM myeloide dysplasi ved flowcytometri prøve forarbejdning og farvning, dataopsamling og fortolkning<sup class="x…

Materials

BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µl and 200µl
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain