Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

Summary

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Abstract

Un groupe de travail initié au sein de l’Association Français de cytométrie en flux (AFC) a été développé afin d’harmoniser l’application de la cytométrie multiparamétrique (MFC) pour le diagnostic myéloïde en France. Le protocole présenté ici a été convenue et appliquée entre septembre 2013 et 2015 de novembre dans six laboratoires diagnostiques Français (centres hospitaliers universitaires de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice et Lille et Institut Paoli-Calmettes dans Marseille) et a permis la normalisation de la moelle osseuse échantillon préparation et acquisition de données. Trois bases de données de maturation ont été développées pour les neutrophiles, monocytes et lignées érythroïde avec la moelle osseuse d’individus donateurs « sain » (individus sans aucune preuve d’une maladie hématopoïétique). Une solide méthode d’analyse pour chaque lignée myéloïde devrait être applicable pour le diagnostic systématique. De nouveaux cas peuvent être analysés de la même façon et comparés à des bases de données habituelles. Ainsi, des anomalies quantitatives et qualitatives phénotypiques peuvent être identifiés et ceux au-dessus de 2SD comparés aux données des échantillons de moelle osseuse normale devraient considérer comme révélateur de la pathologie. La limitation majeure est la variabilité plus élevée entre les données obtenues en utilisant les anticorps monoclonaux obtenus avec les méthodes basées sur les technologies d’hybridomes et actuellement utilisés dans le diagnostic clinique. Établissant des critères de validation technique des données acquises peut contribuer à améliorer l’utilité de MFC pour les diagnostics MDS. La mise en place de ces critères exige l’analyse contre une base de données. La réduction de la subjectivité du chercheur en analyse de données est un important avantage de cette méthode.

Introduction

En l’absence de marqueurs phénotypiques spécifiques aux changements dysplasiques se produisant dans les cellules myéloïdes pendant l’initiation MDS et la progression, une nouvelle approche a été proposée ces dernières années, basée sur l’évaluation des voies de maturation (expression altérée de les antigènes myéloïdes durant la production de cellules myéloïdes matures) ou de la distribution anormale des différents types de cellules dans la moelle osseuse (BM) cellule compartiments^1,2.

Cet article présente une nouvelle méthode d’application normalisée des MFC afin de détecter les changements dysplasiques dans les compartiments de la cellule myéloïde BM associés à des syndromes myélodysplasiques (SMD) ou d’autres maladies hématologiques myéloïdes. Cette étude montre également l’utilité d’utiliser des bases de données de maturation pour l’analyse de données MFC.

Normalisation de la procédure de préparation d’échantillon, d’acquisition de données et analyse en utilisant les bases de données permettrait l’identification des anomalies phénotypiques plus pertinentes liées aux changements dysplasiques dans les cellules myéloïdes BM. Par conséquent, les sous-ensembles statistiquement sélectionnés selon des formats bien étiquetés et reconnus (séparateur de Population automatique (APS) diagrammes, histogrammes et parcelles de dot) sont requis pour développer une stratégie d’analyse qui peut être utilisée dans une analyse ultérieure arrondit. La découverte d’anomalies phénotypiques robustes MDS faciliterait le diagnostic dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et sans aberrancies cytogénétiques. Identification des paramètres discriminatoires permettant la réduction des panneaux immunophénotypiques peut simplifier l’actuel scores², permettant leur applicabilité dans les laboratoires de pathologie clinique.

Cette méthode limite les interprétations subjectives de cytométrie de flux de données, comme ont été signalé en MDS diagnostic³. Cette étape est un préalable à l’élaboration d’outils automatisés pour le traitement et l’analyse des flux de données⁴.

MDS comprend un groupe hétérogène d’affections clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dont les mutations du splicéosome coopèrent avec des modificateurs spécifiques épigénétiques de céder le phénotype MDS. On sait maintenant que, ainsi que des mutations de HSC, autres mécanismes sont impliqués dans la physiopathologie MDS, telles que l’inflammation d’origine immunitaire aberrante et interactions entre autorenouveler maligne et le micro-environnement stromal de la BM. Toutefois, ces mécanismes restent mal compris. L’hétérogénéité large clinique et biologique de MDS rend le diagnostic et le choix de la pharmacothérapie optimale par un défi. Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont montré que les MFC est souvent plus sensible dans la détection de la dysplasie² que la morphologie, mais les contraintes techniques et économiques rendent cette technique difficile à normaliser, avec des résultats souvent selon le le expérience de l’ interprète³. En outre, on ne sait pas comment MFC peut faire pencher la balance vers MDS dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et en l’absence d’anomalies cytogénétiques ou dans des cas limites telles que hypocellular MDS, avec un nombre faible souffle, d’autre non clonale BM des troubles tels que l’insuffisance médullaire (i.e., anémie aplasique). Aussi, il reste difficile de différencier les cas limites de MDS avec un excès de blastes de leucémie myéloïde aiguë (LMA). Pour toutes ces raisons, le Guide de pratique clinique ne s’intègrent pas MFC testing dans le diagnostic final de MDS. En 2011, l’US National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recommandé MFC permettant d’estimer le pourcentage de cellules CD34 +, détection des clones de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne et la présence de clones de lymphocytes T cytotoxiques dans hypocellular MDS⁵. Ces deux derniers cas impliquent également un objectif thérapeutique parce que les données cliniques ont montré une bonne réponse de ces patients à un traitement immunosuppresseur⁶. Les lignes directrices NCCN 2017, citant les recommandations du groupe de travail International (GTI), énumérés immunophénotypage aberrant de détection par MFC parmi les critères Co pour MDS diagnostic, mais sans faire aucune fiche⁶. En outre, la classification de l’OMS publiée récemment stipule que les constatations MFC seules ne suffisent pas établir un diagnostic primaire de MDS en l’absence de données morphologiques et/ou cytogénétique concluantes⁷. Toutefois, les MFC peut servir comme un essai supplémentaire montrant le dérèglement des cellules myéloïdes patrons de maturation et de quantifier la « distance de la normale » pour un patient à un moment précis de l’évolution de la maladie.

Cette méthode est applicable aux laboratoires cliniques intéressés par l’évaluation de dysplasie dans les cellules myéloïdes BM à l’aide de MFC immunophénotypage, afin d’affiner le diagnostic en MDS ou d’autres troubles myéloïdes avec anomalies dysplasiques.

Protocol

Le protocole ci-dessous a été approuvé par le « Comité de Protection des Personnes » (Comité d’éthique indépendant) 1 sud-est de University Hospital de Saint-Etienne, France. 1. paramètres du cytomètre en Remarque : Les paramètres cytomètre ont été réalisés selon les recommandations découlent de la France, conformément à la EuroFlow procédure « protocole d’exploitation EuroFlow Standard (SOP) pour le réglage de l’Instrument et l’inde…

Representative Results

Les 54 échantillons BM récoltés en anticoagulant K-EDTA ont été inclus dans l’étude. Le MFC ont été analysées en l’absence de toute information sur les patients. Étude rétrospective a montré que les échantillons de BM étaient de 7 donneurs sains (5 mâles et 2 femelles avec un âge médian de 47,4 [35-48], 11 personnes sans aucun signe d’une maladie hématopoïétique (8 mâles et 3 femelles avec un âge médian de 57,9 [35-72]) et 36 cas avec divers certaines patholo…

Discussion

La qualité de l’aspiration de la BM pourrait avoir une incidence sur le résultat final. L’hémodilution de l’aspiration de la BM pourrait fausser la distribution des cellules dans les différents stades de maturation en raison de l’absence de cellules souches ou cellules précurseurs. Probablement employant un vrac lyse méthode peut-être contribuer à la normalisation de la ponction de la BM pour l’hémodilution dans les analyses de cytométrie en flux. En outre, les étapes essentielles pour l’évaluatio…

Materials

BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µl and 200µl
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain