Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם
Summary
האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.
Abstract
קבוצת עבודה יזם בתוך האגודה Cytometry צרפתית (AFC) פותחה ומשתלבת בהרמוניה היישום של cytometry זרימה multiparameter (MFC) עבור אבחון מחלת מיאלואידית בצרפת. פרוטוקול המובאת כאן הייתה מוסכמת ושימושית בין ספטמבר 2013 בנובמבר 2015 שש מעבדות אבחון צרפתי (בתי חולים אוניברסיטאיים Saint-Etienne, גרנובל, פראנד, ניס, ואת ליל אינסטיטוט פאולי-Calmettes ב מרסיי) והתירו את התקינה של הכנה דגימת מח עצם ורכישת נתונים. שלושה מסדי נתונים ההבשלה פותחו עבור נויטרופילים, monocytic, ו erythroid שושלות עם מח עצם מאנשים התורם “בריא” (יחידים ללא ראיות של מחלה hematopoietic). שיטה חזקה של ניתוח עבור כל השושלת מיאלואידית צריך להיות ישימים עבור שימוש לאבחון שגרתי. מקרים חדשים יכול להיות מנותח באופן זהה, לעומת נגד מסד הנתונים הרגיל. לפיכך, ניתן לזהות חריגות פנוטיפי כמותיים ואיכותניים, אלה מעל 2SD לעומת הנתונים של דגימות מח עצם נורמלי לשקול מעידה על פתולוגיה. המגבלה העיקרית היא ההשתנות גבוה יותר בין נתוני מושגת באמצעות נוגדנים חד-שבטיים שהושג עם השיטות המבוססים על טכנולוגיות ליפידים ומשמשים כיום אבחון קליני. הגדרת קריטריונים עבור אימות טכני של הנתונים רכשה עשוי לסייע בשיפור השירות של MFC לאבחונים MDS. הקמתה של קריטריונים אלה דורש ניתוח מול מסד נתונים. ההפחתה של החוקר הסובייקטיביות בניתוח נתונים היא יתרון חשוב של שיטה זו.
Introduction
בהיעדר ספציפית לשינויים dysplastic המתרחשים בתאי מיאלואידית במהלך החניכה MDS, התקדמות פנוטיפי סמנים, גישה חדשה הוצע בשנים האחרונות, בהתבסס על הערכת המסלולים ההבשלה (ביטוי שונה של אנטיגנים מיאלואידית במהלך הייצור של התאים מיאלואידית בוגרים) או של התפלגות נורמלית של סוגי תאים שונים בתוך מח העצם (מוניטור) תאים תאים1,2.
מאמר זה מציג שיטה חדשה עבור יישום מתוקננת של MFC כדי לזהות שינויים dysplastic בתאים התאים מיאלואידית מוניטור הקשורות תסמונות myelodysplastic (MDS) או מחלות אחרות hematological מיאלואידית. מחקר זה מראה גם את תוכנית השירות של שימוש ההבשלה מסדי נתונים עבור ניתוח נתונים MFC.
סטנדרטיזציה של הליך הכנת המדגם, חדרי קירור והקפאה, ניתוח באמצעות מסדי הנתונים יאפשר זיהוי ליקויים פנוטיפי הרלוונטיים ביותר הקשורים לשינויים dysplastic בתאי מיאלואידית מוניטור. לכן, קבוצות משנה סטטיסטית הנבחר בהתבסס על תבניות הלחצנים הוסף מוכרת היטב (דיאגרמות מפריד האוכלוסייה אוטומטי (APS), היסטוגרמות, וחלקות נקודה) נדרשים עבור פיתוח אסטרטגיית ניתוח יכול לשמש לאחר מכן ניתוח סיבובים. גילוי מומים פנוטיפי חזק ב- MDS תקל את האבחנה במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלית וללא cytogenetic aberrancies. זיהוי של פרמטרים מפלה המאפשר צמצום של לוחות immunophenotypic עשויה לפשט הנוכחי ציונים2, המתיר שלהם הישימות במעבדות קליניות פתולוגיות.
שיטה זו מגבילה את הפרשנות הסובייקטיבית של cytometry נתונים, כמו היה לשלוח אותן ב- MDS אבחון3. שלב זה הוא תנאי הכרחי להתפתחות של כלים אוטומטיים עבור עיבוד וניתוח זרימת נתונים4.
MDS כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות המשובטים תאי גזע hematopoietic (HSC) שבו מוטציות ספלייסוזום לשתף פעולה עם הספציפיים המגבילים epigenetic להניב תשואה של פנוטיפ MDS. כיום ידוע כי יחד עם מועדון הכדורגל מונפלייה מוטציות, מנגנונים אחרים המעורבים פתופסיולוגיה MDS, כגון דלקת בתיווך החיסונית סוטה אינטראקציות בין ממאיר HSCs את microenvironment סטרומה של ויטביע. עם זאת, מנגנונים אלה נשארים ממעטים להבין. הטרוגניות לרווחה קליניים והביולוגיה של MDS הופך האבחון, הבחירה של הטיפול האופטימלי אתגר. בעשור האחרון, מחקרים רבים הראו כי ה-MFC הוא לעיתים קרובות יותר רגיש באיתור דיספלזיה2 יותר מורפולוגיה, אבל אילוצים טכניים וכלכליים לעשות את הטכניקה הזו קשה לתקנן, עם תוצאות קרובות בהתאם ניסיון של מתורגמן3. בנוסף, לא ברור איך MFC יכול להטות את הכף לכיוון MDS במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלי, בהיעדר חריגות cytogenetic, או במקרים גבוליים כגון hypocellular MDS, עם ספירה נמוכה הפיצוץ, מן מוניטור אחרים שאינם המשובטים הפרעות כגון אי ספיקת מח עצם (כלומר., אנמיה אפלסטית). זה גם נשאר קשה להבדיל בין מקרים גבוליים של MDS עם עודף של תקיעות לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מכל הסיבות האלה, ההנחיות הקלינית אינם משתלבים MFC בדיקות לתוך האבחנה הסופית של MDS. בשנת 2011, ארצות הברית הלאומית מקיף סרטן רשת (NCCN) מומלצת MFC ההערכה של האחוז של תאי CD34 +, זיהוי של שיבוטים hemoglobinuria ליליות התקפי, ונוכחות של שיבוטים ציטוטוקסיות תא T ב- MDS hypocellular5. אלה שני מצבים האחרון כרוך גם מטרה טיפולית כי נתונים קליניים הראו תגובה טובה של חולים אלו טיפול לדיכוי המערכת החיסונית6. הנחיות NCCN 2017, בצטטו את המלצות קבוצת העבודה הבינלאומית (IWG), רשום immunophenotyping סוטה זיהוי על-ידי MFC מהקריטריונים שיתוף לאבחון MDS, אך ללא ביצוע כל מפרטי6. בנוסף, סיווג WHO שפורסמו לאחרונה קובע כי הממצאים MFC לבד אינן מספיקות כדי לבסס אבחון ראשי של MDS, בהעדר נתונים מורפולוגיים ו/או cytogenetic חד7. עם זאת, MFC יכול לשמש מבחן נוסף מציג dysregulation של התאים מיאלואידית ההבשלה דפוסי וכימות “מרחק מן הרגיל” עבור חולה בזמן מסוים בקורס המחלה.
שיטה זו ישימה במעבדות קליניות מעוניין בהערכה של דיספלזיה בתאי מיאלואידית מוניטור באמצעות MFC immunophenotyping, על מנת לחדד את האבחנה MDS או הפרעות אחרות מיאלואידית עם מומים dysplastic.
Protocol
Representative Results
Discussion
האיכות של מוניטור וביופסיה יכול להשפיע על התוצאות הסופיות. Hemodilution של וביופסיה מוניטור יכול לעוות את חלוקת תאים בשלבים שונים של ההבשלה בשל היעדרם של אבות או תאים סימנים מקדימים. כנראה העסקת בכמויות גדולות lysing שיטת עשוי לעזור בנורמליזציה של מוניטור aspirates עבור hemodilution זרם cytometric בניתוח. בנוסף,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נוגדנים השתמשו במחקר זה נמסרו בידי החיים BD. המחברים רוצה להודות שלהם עמית, ד ר פסקל Flandrin-Gresta, מ המחלקה לביולוגיה מולקולרית, המעבדה להמטולוגיה, אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת, שסיפק מומחיות לפרשנויות של נתונים המיתרים השנייה במקרה של MDS. המחברים מודים ההמטולוגים המטפל שלהם עניין ומעורבות במחקר זה, על המטופלים ועל בריא לתורמים את הסכמתם להשתתף במחקר זה. המחברים רוצה גם להודות הקרן “Les אמיס דה Rémi” תמיכה כספית עבור פרסום.
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes – proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).
- . https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018)
- . . Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- . . EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
