Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Summary

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Abstract

Um grupo de trabalho iniciado dentro francês citometria de associação (AFC) foi desenvolvido a fim de harmonizar a aplicação da citometria de fluxo multiparâmetros (MFC) para o diagnóstico de doença mieloide na França. O protocolo aqui apresentado foi estabelecido e aplicado entre setembro de 2013 e de 2015 novembro seis laboratórios de diagnóstico francês (hospitais universitários de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice e Lille e Institut Paoli-Calmettes em Marselha) e permitiu a padronização de aquisição de dados e preparação de amostra da medula óssea. Três bancos de dados de maturação foram desenvolvidos para neutrófilos, monocítica e linhagens eritroide com medula óssea de indivíduos “saudáveis” doador (indivíduos sem qualquer evidência de doenças hematopoiéticas). Um método robusto de análise para cada linhagem mieloide deve ser aplicável para o uso rotineiro de diagnóstico. Novos casos podem ser analisados da mesma maneira e comparados com os bancos de dados de sempre. Assim, quantitativas e qualitativas de anormalidades fenotípicas podem ser identificadas e aqueles acima 2SD comparado com dados de amostras normais da medula óssea devem ser consideradas indicativas de patologia. A principal limitação é a maior variabilidade entre os dados obtidos usando os anticorpos monoclonais obtidos com os métodos baseados em tecnologias de hibridoma e atualmente utilizados no diagnóstico clínico. Definição de critérios para validação técnica dos dados adquiridos pode ajudar a melhorar a utilidade do MFC para diagnósticos MDS. O estabelecimento destes critérios exige análise contra um banco de dados. A redução da subjetividade do investigador na análise de dados é uma importante vantagem deste método.

Introduction

Na ausência de marcadores fenotípicos específicos para as alterações displásicas ocorrem em células mieloides durante a iniciação de MDS e progressão, foi proposta uma nova abordagem em anos recentes, com base na avaliação de vias de maturação (expressão alterada de antígenos mieloides durante a produção de células mieloides maduras) ou da distribuição anormal de diferentes tipos de células na medula óssea (BM) de células compartimentos^1,2.

Este artigo apresenta um novo método para aplicação padronizada do MFC, a fim de detectar alterações displásicas em compartimentos de células mieloides BM relacionados a Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou outras doenças hematológicas mieloides. Este estudo também mostra a utilidade do uso de bancos de dados de maturação para análise de dados MFC.

Padronização do procedimento de preparação de amostra, aquisição de dados e análise usando os bancos de dados permitiria identificar as anormalidades fenotípicas mais relevantes relacionadas com alterações displásicas em células mieloides BM. Portanto, subconjuntos estatisticamente selecionados com base em formatos bem marcados e bem reconhecidos (diagramas de separador de população automática (APS), histogramas e lotes do ponto) são necessários para o desenvolvimento de uma estratégia de análise que pode ser usada na análise subsequente rondas. A descoberta de anormalidades fenotípicas robustas em MDS facilitariam o diagnóstico em casos com ou sem displasia morfológica mínima e sem aberrancies de citogenéticas. Identificação dos parâmetros discriminatórios para a redução dos painéis imunofenotípica pode simplificar o atual escores², permitindo a sua aplicabilidade em laboratórios de patologia clínica.

Este método limita as interpretações subjetivas de citometria dados, como tem sido sinalizado no MDS diagnóstico³. Esta etapa é um pré-requisito para o desenvolvimento de ferramentas automatizadas para processamento e análise de fluxo de dados⁴.

MDS compreende um grupo heterogêneo de desordens de células-tronco hematopoéticas clonais (HSC), em que as mutações spliceossoma cooperarem com modificadores epigenéticas específicas para produzir o fenótipo do MDS. Agora sabe-se que, juntamente com as mutações do HSC, outros mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia do MDS, tais como inflamação mediada por imune aberrante e interações entre linfócitos malignos e o microambiente do estroma do BM. No entanto, estes mecanismos permanecem mal compreendidos. A heterogeneidade ampla clínica e biológica da MDS faz o diagnóstico e seleção da terapia ideal um desafio. Na última década, vários estudos têm mostrado que MFC é muitas vezes mais sensível na detecção de displasia² do que a morfologia, mas as restrições técnicas e econômicas dificultam essa técnica padronizar, com resultados muitas vezes dependendo do experiência do intérprete³. Além disso, não está claro como MFC pode pender a balança em direção a MDS com ou sem displasia morfológica mínima nos casos e na ausência de anomalias citogenéticas ou em casos-limite como hipocelular MDS, com uma contagem baixa de explosão, de outro não-clonal BM doenças como a insuficiência de medula óssea (i. e., anemia aplástica). Também continua a ser difícil diferenciar casos-limite da MDS com excesso de blastos da leucemia mieloide aguda (LMA). Por todas estas razões, as diretrizes clínicas não integrar a MFC testes para o diagnóstico final do MDS. Em 2011, a rede de câncer abrangente nacional dos EUA (NCCN) recomendado MFC para a estimativa da percentagem de células CD34 +, detecção de clones de hemoglobinúria paroxística noturna e presença de clones de células T citotóxicas em hipocelular MDS⁵. Estas duas situações este último também envolvem um objetivo terapêutico porque dados clínicos mostraram uma boa resposta desses pacientes a terapia imunossupressora⁶. As diretrizes NCCN 2017, citando as recomendações do grupo de trabalho internacional (GTI), listado immunophenotyping aberrante deteção pelo MFC entre os co critérios para o diagnóstico do MDS, mas sem fazer quaisquer especificações⁶. Além disso, a classificação WHO publicada recentemente estipula que as conclusões de MFC sozinhos não são suficientes para estabelecer um diagnóstico primário de MDS na ausência de dados conclusivos morfológica e/ou citogenética⁷. No entanto, MFC pode ser usado como um teste adicional mostrando o dysregulation do célula mieloide padrões de maturação e quantificar a “distância normal” para um paciente em um momento específico do curso da doença.

Este método é aplicável em laboratórios clínicos interessados na avaliação de displasia em células mieloides BM, usando MFC immunophenotyping, a fim de refinar o diagnóstico em MDS ou outros distúrbios mieloides com anormalidades displásicos.

Protocol

O protocolo listado abaixo foi aprovado pelo “Comité de Protection des Personnes” (Comitê de ética independente) 1 Sud-Est da Universidade Hospital de Saint-Etienne, França. 1. citômetro de configurações Nota: As configurações de citômetro foram realizadas de acordo com recomendações de fluxo de França, em conformidade com o procedimento EuroFlow “EuroFlow operacional protocolo padrão (SOP) para instalação do instrumento e a compensação (https://www….

Representative Results

As 54 amostras de BM colhidas em anticoagulante EDTA-K foram incluídas no estudo. Analisaram-se os dados do MFC na ausência de qualquer informação sobre os pacientes. Estudo retrospectivo mostrou que as amostras de BM eram de 7 doadores saudáveis (5 machos e 2 fêmeas com idade mediana de 47,4 [35-48], 11 indivíduos sem evidência de doença hematopoiética (8 machos e 3 fêmeas com idade mediana de 57.9 [35-72]) e 36 casos com vários condições patológicas: 1 caso com anemia e …

Discussion

A qualidade do aspirado BM poderia impactar os resultados finais. A hemodiluição do aspirado BM pode distorcer a distribuição de células em diferentes estágios de maturação devido à ausência dos progenitores ou precursores. Provavelmente, empregar um granel lise método pode ajudar na normalização da BM aspirados por hemodiluição em análises de fluxo cytometric. Além disso, os passos críticos para a avaliação da displasia mieloide BM por citometria de fluxo são o exemplo de processamento e coloração…

Materials

BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µl and 200µl
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain