Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için
Summary
MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.
Abstract
Fransızca sitometresi Derneği (AFC) içinde başlatılan bir çalışma grubu miyeloid hastalık tanı Fransa multiparameter akış sitometresi (MFC) uygulama uyum amacıyla geliştirilmiştir. Burada sunulan protokolü üzerinde anlaşılan ve Eylül 2013 ve Kasım 2015 yılları arasında uygulanan altı Fransız tanı Laboratuarı (Üniversite Hastaneleri Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice ve Lille ve Institut Paoli-Calmettes oldu Marsilya) ve kemik iliği örnek hazırlama ve veri toplama standardizasyon izin verdi. Üç olgunlaşma veritabanı nötrofil, Monositik, ve erythroid soy “sağlıklı” donör bireyler (bireyler hematopoetik hastalık herhangi bir kanıt olmadan) kemik iliği ile geliştirilmiştir. Analiz sağlam bir yöntem her miyeloid lineage için rutin tanı kullanım için uygulanabilir olmalıdır. Yeni olgu aynı şekilde analiz ve her zamanki veritabanlarının karşı karşılaştırıldığında. Böylece, nicel ve nitel fenotipik anormallikler tespit edilmesi ve bu normal kemik iliği örnekleri verilerle karşılaştırıldığında 2SD yukarıda gösterge patolojisi düşünülmelidir. Daha yüksek değişkenlik Hibridoma teknolojilerini temel alan ve şu anda klinik tanıda kullanılan yöntemleri ile elde edilen monoklonal antikor kullanılarak elde veriler arasında büyük kısıtlamadır. Alınan veri teknik doğrulama ölçütlerini ayar MFC yardımcı programı için MDS diagnostics artırmanıza yardımcı olabilir. Bu kriterler kurulması bir veritabanıyla analiz gerektirir. Veri Analizi araştırmacı öznellik azalma bu yöntemin önemli bir avantajdır.
Introduction
Fenotipik işaretleri myeloid hücrelerin MDS başlama ve ilerleme sırasında meydana gelen displastik değişiklikler için belirli yokluğunda, olgunlaşma yolları (değiştirilmiş ifade değerlendirmesine dayanarak son yıllarda yeni bir yaklaşım önerilmiştir myeloid antijenleri olgun myeloid hücrelerin üretimi sırasında) veya kemik iliği (BM) içinde farklı hücre türleri anormal dağılımı bölmeleri1,2hücre.
Bu makale myelodisplastik sendrom (MDS) veya diğer myeloid hematolojik hastalıklar ile ilgili BM myeloid hücre bölmeleri displastik değişiklikleri algılamak için MFC standart uygulanması için yeni bir yöntem sunar. Bu çalışma aynı zamanda MFC veri analizi için olgunlaşma veritabanları kullanmanın yardımcı programını gösterir.
Örnek hazırlama yordamı, veri toplama ve Analizi veritabanlarını kullanarak standardizasyon BM myeloid hücrelerin displastik değişiklikler ile ilgili en alakalı fenotipik anormallikler tanımlaması sağlayacak. Bu nedenle, iyi etiketli ve iyi tanınan biçimlerinin (otomatik popülasyon ayırıcı (APS) diyagramları, çubuk grafikler ve nokta araziler) dayalı istatistiksel olarak seçilen alt kümeleri sonraki analizinde kullanılan bir analizi strateji geliştirmek için gerekli olan yuvarlar. MDS sağlam fenotipik anormallikleri keşfi ile veya minimal morfolojik displazi ve sitogenetik aberrancies olmadan durumlarda tanı hafifletir miydi. İmmunophenotypic panelleri azaltılması için izin ayrımcı parametreleri tanımlaması onların uygulanabilirliği klinik patoloji laboratuarlarında izin geçerli puanları2, kolaylaştırmak.
Bu yöntem sitometresi veri, öznel yorumlarını MDS tanı3‘ te sinyal olarak sınırlar. Bu adım işleme ve akış veri4analiz otomatik araçları geliştirilmesi için bir önkoşuldur.
MDS klonal hematopoetik kök hücre (HSC) bozuklukları spliceosome mutasyonlar MDS fenotip vermeye belirli epigenetik değiştiriciler ile işbirliği heterojen bir grup oluşur. Şimdi HSC mutasyonlar ile birlikte diğer mekanizmaları anormal Bağışıklık-aracılı inflamasyon ve malign HSCs ve BM stromal microenvironment arasındaki etkileşimler gibi MDS patofizyolojisi katılmaktadırlar, bilinen. Ancak, bu mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. MDS geniş klinik ve biyolojik heterojen tanı ve en uygun tedavi yelpazesi bir meydan okuma yapar. Son on yılda birden fazla çalışmalar MFC kez daha olduğunu göstermiştir içinde hafiye displazi2 morfoloji ama teknik ve ekonomik kısıtlamaları daha duyarlı olun bu teknik, sonuçlar genellikle bağlı olarak standart hale getirmek zor Tercüman3deneyim. Ayrıca, nasıl MFC minimal morfolojik displazi olgularının ve sitogenetik anomali yokluğu veya hypocellular MDS, düşük patlama sayısı, olan gibi sınırda durumlarda denge MDS doğru klonal olmayan diğer BM ipucu belli değil kemik iliği yetmezliği gibi bozukluklar (i.e., aplastik anemi). Ayrıca akut miyeloid lösemi (AML) MDS sınırda durumlarda patlamalar bir fazlalığı ile ayırt etmek zor kalır. Tüm bu nedenlerden dolayı MFC MDS son tanı test klinik yönergeleri entegre değil. 2011 yılında ABD Ulusal kapsamlı kanser ağ (NCCN) CD34 + hücre yüzdesi, paroksismal nokturnal hemoglobinuria klonlar tespiti ve sitotoksik T Hücre klonlar hypocellular MDS5varlığı tahmini için MFC önerilir. Klinik veri immünsüpresif tedavi6bu hastaların iyi bir tepki göstermiştir olduğundan bu iki ikinci durum terapötik bir hedef de içerir. Uluslararası çalışma grubu (IWG) öneriler, gerekçe göstererek 2017 NCCN yönergeleri MFC tarafından anormal immunophenotyping algılama MDS tanı için ama herhangi bir özellikleri6yapmadan Co kriterlerin yanında listelenir. Buna ek olarak, kısa bir süre önce WHO sınıflandırma MFC bulgular yalnız MDS birincil tanısı kesin morfolojik ve/veya sitogenetik veri7yokluğunda kurmak için yeterli değildir öngörülüyor. Ancak, MFC olgunlaşma desenleri myeloid hücre bozukluk gösteren ve “mesafe”–dan normal bir hasta için hastalık sahası içinde belirli bir zamanda miktarının ek bir test olarak kullanılabilir.
Bu yöntem klinik laboratuvarlarında çalışan BM myeloid hücrelerin MDS veya displastik anormallikler ile diğer myeloid bozuklukları tanı iyileştirmek için MFC immunophenotyping, kullanarak displazi değerlendirilmesi ile ilgilenen geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
BM aspiratı kalitesini final sonuçlarına etkisi olabilir. BM aspiratı hemodilution hücrelerin CSF’den olgunlaşma olmaması nedeniyle, farklı evrelerinde veya öncül hücrelerin dağıtım deforme. Muhtemelen bir toplu yöntemi lysing istihdam hemodilution akış sitometrik analizlerde için BM boğulmadan normalleştirme yardımcı olabilir. Ayrıca, BM miyeloid displazi değerlendirilmesi için kritik adımlar akış sitometresi tarafından işleme ve boyama örnek, veri toplama ve yorumu2</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kullanılan antikor BD Biosciences tarafından temin edilmiştir. Yazarlar kendi meslektaşı Dr Pascale Flandrin-Gresta, düşük moleküler biyoloji bölümü, Hematoloji Laboratuvarı, Üniversitesi Hastanesi Saint-Etienne, ikinci NGS verilerin yorumlanması için uzmanlık sağlayan Fransa, teşekkür etmek istiyorum MDS durumda. Yazarlar için klinisyen hematolog ve hastalar ve sağlıklı bağış bu çalışmaya katılmak onların anlaşma için ilgi ve bu çalışma katılımı için müteşekkiriz. Yazarlar ayrıca “Les Amis de Rémi” Vakfı yayını için finansal destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes – proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).
- . https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018)
- . . Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- . . EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
