Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans
Summary
Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.
Abstract
In dit protocol, een fusieproteïne van groene fluorescentie proteïne (GFP) en 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring worden gebruikt voor het bijhouden van eiwit subcellular localisatie wijzigingen; in het bijzonder benadrukken een nucleaire translocatie onder een hitte voorwaarde. Eiwitten reageren dienovereenkomstig aan externe en interne signalen. Een gemeenschappelijk mechanisme is om te veranderen zijn subcellular localisatie. Dit artikel beschrijft een protocol voor het bijhouden van de lokalisatie van eiwit dat niet nodig een antilichaam, radioactieve labeling of een confocal microscoop. In dit artikel, wordt GFP gebruikt voor het label van de doel-proteïne EXL-1 in C. elegans, een lid van de chloride kanaal van intracellulaire eiwitten (CLICs) familie, waaronder zoogdieren CLIC4. Een geïntegreerde translationeel exl-1::gfp transgene lijn (met een promotor en een volledige gensequentie) werd bedacht door transformatie en γ-straling en stabiel de gene en gfpuitdrukt. Recent onderzoek toonde aan dat bij hittestress, niet oxidatieve stress, EXL-1::GFP hoopt zich op in de kern. Overlappende het GFP-signaal met zowel de structuur van de atoomkernen en de DAPI signalen bevestigt de EXL-1 subcellular localisatie wijzigingen onder stress. Dit protocol stelt twee verschillende fixatie methoden voor DAPI kleuring: fixatie van ethanol en aceton fixatie. De DAPI kleuring protocol gepresenteerd in dit artikel is snel en efficiënt en zowel het GFP-signaal en de eiwit subcellular localisatie wijzigingen blijven behouden. Deze methode vereist alleen een fluorescentie Microscoop met Nomarski, een FITC-filter en een DAPI-filter. Het is geschikt voor de instelling van een klein laboratorium, undergraduate student onderzoek, middelbare school student onderzoek en biotechnologie klaslokalen.
Introduction
Een verandering van eiwit subcellular localisatie is een gemeenschappelijk mechanisme in reactie op interne of externe signalen zoals hittestress, honger, oxidatieve stress, apoptosis, proteïne fosforylatie en anderen. Bijvoorbeeld induceert hittestress een FOXO lid1,2van de nucleaire translocatie van de DAF-16 en de pro-apoptotic BCL-2 eiwit die bod translocates aan de mitochondriën bij ontvangende overlijden signalering van3,4. Verschillende technieken zijn beschikbaar om deze wijzigingen te herkennen. Een combinatie van het westelijke bevlekken en biochemically isoleren subcellular structuren (bv, mitochondriën of de kernen) konden goed het bereiken van de doelstelling3. Het vereist echter een specifiek antilichaam tegen het eiwit van belang. Zo wordt een gevestigde antilichaam de sleutel tot het succes. Een alternatieve benadering is etikettering van verschillende subcellular structuren of organellen met verschillende markeringen zoals groene fluorescentie proteïne (GFP), rode fluorescentie eiwit (RFP), gele fluorescentie eiwit (YFP) en mCherry, en ondertussen de proteïne van label belang met andere markeringen. Dan, om hen onder een confocal microscoop te lokaliseren de doelstellingen5,6te observeren. Radioactieve isotopen zijn een alternatieve keuze voor het benoemen van doel eiwitten en vervolgens hun subcellular localisatie7opsporen. Echter, deze methode vereist een goede opleiding en de behandeling van radioactief afval. Omstandigheden zoals het gebrek aan een specifiek antilichaam, het ontbreken van een goede marker, of de schaarste van apparatuur, zoals een confocal microscoop moet een alternatieve aanpak worden overwogen. Ter identificatie van een nucleaire translocatie van eiwit, is het aantrekkelijk label alleen de doel-eiwitten met een marker en vlek kernen met het chemisch reagens 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) omdat dit alleen een regelmatige fluorescentie Microscoop vereist.
Immunolabeling, C. elegans met antilichamen is uitdagend vanwege de lage permeabiliteit van de “eggshell” of de collagene cuticle rondom het dier. Ondertussen, aangezien C. elegans eiwitten beduidend verschillend van hun gewervelde orthologs zijn, een paar commerciële bedrijven voorzien van C. elegans specifieke producten. Het is moeilijk voor een klein laboratorium voor het genereren van C. elegans antilichamen voor zichzelf. Onderzoekers in de Gemeenschap gebruiken vaak tagged eiwitten als markers om aan te tonen van een eiwit lokalisatie of gen-expressie. In dit artikel gebruikt EXL-1::GFP als voorbeeld voor het bijhouden van een nucleaire translocatie van eiwit onder hitte stress8. Een geïntegreerde translationeel exl-1::gfp in het genoom van dieren wordt gebruikt om het stabiel express het gen met gfp fusie. Onderzoek heeft uitgewezen dat exl-1 wordt uitgedrukt in de darm, lichaam muur spier en andere subcellular structuren8. Dit protocol laat zien hoe om te synchroniseren van wormen naar de vierde larvale fase (L4), voert u een hitte stress experiment, en gedrag DAPI kleuring, ethanol fixatie, aceton fixatie en beeldvorming onder een regelmatige fluorescentie Microscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel voorgesteld een snelle en efficiënte methode om te controleren of eiwit subcellular wijzigingen ten opzichte van het cytoplasma naar de kern. De eiwituitdrukking bleek ontstaan door een fusie van GLP, terwijl de kern structuur werd gecontroleerd door de DAPI kleuring (Figuur 3). Aangezien immunokleuring C. elegans eiwitten is uitdagend, meeste C. elegans eiwit subcellular lokalisaties worden gekenmerkt door tagging hen met marker eiwitten zoals GFP Laz, mChe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De stammen van de C. elegans gebruikt in deze studie werden verkregen uit de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt ondersteund door de National Institutes of Health – Office van onderzoek infrastructuur-programma’s (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door de NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang en PSC-CUNY 66184-00 44 en 67248-00 45 tot Jun Liang. Wij danken Cathy Savage-Dunn voor de kandidatuur delen haar laboratorium ruimte. Alle afbeeldingen van de fluorescentie werden verzameld bij Queens College Core faciliteit. Wij danken William J. Rice voor zijn opmerkingen over het manuscript.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , (2006).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. 유전학. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
