Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans
Summary
Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.
Abstract
En este protocolo, una proteína de fusión de fluorescencia verde (GFP) de proteína y 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción se utilizan para el seguimiento de los cambios de localización subcelular de proteínas; en particular, una translocación nuclear bajo un calor estrés condición. Las proteínas reaccionan señales correspondientemente a internos y externas. Un mecanismo común es cambiar su localización subcelular. Este artículo describe un protocolo para el seguimiento de localización de la proteína que no requieren un anticuerpo etiquetado radiactivo y un microscopio confocal. En este artículo, GFP se utiliza para etiquetar la proteína diana EXL-1 de C. elegans, un miembro de la familia de proteínas (Predescargado) cloruro canal intracelular, incluyendo CLIC4 mamíferos. Una línea transgénica de traslación integrado exl-1::gfp (con un promotor y una secuencia del gen completo) fue creada por transformación y γ-radiación y estable expresa el gene y gfp. Recientes investigaciones demostraron que al estrés por calor, el estrés oxidativo no, EXL-1::GFP se acumula en el núcleo. Superposición de la señal GFP con la estructura de los núcleos y el DAPI señales confirma los cambios de la localización subcelular de EXL-1 bajo estrés. Este protocolo presenta dos métodos de fijación diferentes para tinción DAPI: fijación fijación del etanol y acetona. El protocolo de tinción DAPI presentado en este artículo es rápido y eficiente y conserva la señal GFP y los cambios de localización subcelular de la proteína. Este método sólo requiere un microscopio de epifluorescencia con un filtro DAPI, Nomarski y un filtro FITC. Es conveniente para un ambiente pequeño laboratorio, investigación de estudiante de pregrado, investigación de estudiante de secundaria y aulas de biotecnología.
Introduction
Un cambio de la localización subcelular de la proteína es un mecanismo común en respuesta a señales internas o externas como el estrés por calor, hambre, estrés oxidativo, apoptosis, fosforilación de proteínas y otros. Por ejemplo, estrés por calor induce un miembro FOXO DAF-16 translocación nuclear1,2y la proteína del BCL-2 pro-apoptótica que BID se transloca a la mitocondria a muerte recibe señalización3,4. Varias técnicas están disponibles para detectar estos cambios. Una combinación de western blot y aislar bioquímicamente estructuras subcelulares (p. ej., mitocondrias o el núcleo) bien podría alcanzar la meta de3. Sin embargo, requiere un anticuerpo específico contra la proteína de interés. Por lo tanto, un anticuerpo bien establecido se convierte en la clave del éxito. Un enfoque alternativo es rotular diferentes estructuras subcelulares u organelos con diversos marcadores como la proteína de fluorescencia verde (GFP), proteína de la fluorescencia roja (RFP), proteína de fluorescencia amarilla (YFP) y mCherry, y mientras tanto la proteína de la etiqueta interés con otros marcadores. Entonces, los observa bajo un microscopio confocal para localizar los objetivos5,6. Isótopos radiactivos son una alternativa para el etiquetado de las proteínas de la blanco y entonces detectar su localización subcelular7. Sin embargo, este método requiere una formación adecuada y el manejo de desechos radiactivos. En circunstancias como la falta de un anticuerpo específico, la ausencia de un marcador adecuado o el scarceness de equipos como el microscopio confocal, un enfoque alternativo debe ser considerado. Para identificar un desplazamiento nuclear de la proteína, es atractivo solamente etiquetar las proteínas de la blanco con un marcador y para teñir los núcleos con el reactivo químico 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ya que esto sólo requiere un microscopio de fluorescencia regular.
C. elegans de la inmunomarcación con anticuerpos es difícil debido a la baja permeabilidad de la cáscara de huevo o de la cutícula colagenosa que rodea el animal. Mientras tanto, ya que las proteínas de C. elegans son significativamente divergentes de sus ortólogos vertebrados, algunas compañías comerciales proporcionan C. elegans con productos específicos. Es difícil para un pequeño laboratorio generar anticuerpos C. elegans por sí mismos. Los investigadores en la comunidad suelen ser etiquetadas proteínas como marcadores para demostrar una expresión de localización o gen de la proteína. Este artículo utiliza EXL-1::GFP como un ejemplo a seguir un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor8. Una traslación integrado exl-1::gfp en el genoma de animales se utiliza para expresar estable el gen con la fusión de gfp . La investigación demostró que exl-1 se expresa en intestino, músculo de la pared del cuerpo y otras estructuras subcelulares8. Este protocolo muestra cómo sincronizar los gusanos para el cuarto lugar larvario (L4), realice una calor estrés experimento y conducta tinción DAPI, etanol de la fijación, fijación de acetona y la proyección de imagen en un microscopio de fluorescencia regular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta un método rápido y eficiente para verificar cambios subcelular de proteínas desde el citoplasma al núcleo. La expresión de la proteína fue demostrada por la fusión de GFP, mientras que la estructura del núcleo se verificó por DAPI tinción (figura 3). Desde proteínas de C. elegans inmunotinción es desafiante, más localizaciones subcelulares proteína de C. elegans se caracterizan por etiquetado con proteínas marcadoras como GFP, Laz, mCh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las cepas de C. elegans utilizadas en este estudio se obtuvieron en el centro de genética de Caenorhabditis, que es apoyado por los institutos nacionales de salud – oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por los NIH: 1R03AG048578-01 a Jun Liang, CUNY CCRG 1501 a Jun Liang y PSC-CUNY 66184-00 44 y 45 de 67248-00 a Jun Liang. Agradecemos a Cathy salvaje-Dunn para compartir amablemente su espacio de laboratorio. Todas las imágenes de fluorescencia se recolectaron en instalaciones centrales de Queens College. Agradecemos a William J. Rice por sus comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
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