تحليل N-جليكانس من الزعفران فجل أصناف بنغازي استخدام ح+
Summary
يصف لنا طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (الزعفران فجل).
Abstract
في السنوات الأخيرة، مويتيس الكربوهيدرات من النباتات قد حظي باهتمام كبير، كما مصدر محتمل للاستجابات المناعية تحسن، والمثيرة للحساسية. وباﻹضافة إلى ذلك، هياكل الكربوهيدرات أيضا أن تلعب دوراً حاسما في الأيض النباتية. وهنا، يقدم طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (فجل الزعفران) باستخدام N-جليكاناسي محددة للإفراج عن هياكل الكربوهيدرات المشتقة من النباتات. ولتحقيق ذلك، رواسب الخام التريكلوروسيتيك حامض من الفجل هوموجيناتيس تعامل مع بنغازي ح+، والمسمى باستخدام 2-أمينوبينزاميدي كعلامة نيون. حللت العينات-جليكان نالمسمى فيما بعد بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين وقت للطيران (استخدام-TOF) الطيف الكتلي لهيكلي مفصلة وفائقة الأداء اللوني السائل (أوبلك) فصل تقييم وتقدير أبوندانسيس النسبية لهياكل المستمدة من الفجل-جليكان ن. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل N-جليكانس من مختلف الأنواع النباتية الأخرى، وقد يكون من المفيد إجراء مزيد من التحقيقات للدالة وآثار N-جليكانس على صحة الإنسان.
Introduction
N-جليكانس في النباتات قد لفتت الانتباه المتزايد في السنوات الأخيرة، كما أبرزت البحوث السابقة N-جليكانس كمصدر محتمل كروسريكشنز المناعية التي قد تثير حساسية ردود1،2 . وقد ثبت سابقا أن N-جليكانس على جليكوبروتينس النباتية يمكن أن تؤثر على نشاط الحفاز3،4، ثبات وقابلة للطي5،6 أو التعريب سوبسيلولار و 7من إفراز. من أجل ربط هياكل جليكان مع المهام المنوطة بها، N-جليكانس يجب أولاً الإفراج عن من جليكوبروتينس أما كيميائيا أو انزيماتيكالي. هو الأسلوب الكيميائية الكلاسيكية للإفراج عن كل من N-و يا-جليكانس β-القضاء، الذي يرافق العلاج عينة القلوية الحد مع بورهيدريد تؤتي الديتول8. ومع ذلك، هذا الإجراء يحول دون وضع العلامات مع فلوروفوري وتسبب تسوس كبيرة من وحدات أحادي من نهاية الحد من هيكل جليكان. ديجليكوسيليشن الكيميائية استناداً إلى معاملة هيدروكسيد الأمونيوم/كربونات هو أيضا طريقة بديلة المستخدمة عادة9. أيا من هذه الأساليب الإفراج عن المواد الكيميائية يحط البروتينات سليمة، مما يسمح التحليل الشامل والمطيافيه برك جليكان غير مسمى دون تدخل الشظايا الببتيد في نفس النطاق الشامل. ومع ذلك، هو عيب واحد من هذه الأساليب معدل التدهور المتزايد α1, N3-فوكوسيلاتيد-جليكانس، العثور على هيكل مشترك الكربوهيدرات في النباتات10. وبدلاً من ذلك، الإصدار الانزيمية أساليب استخدام الببتيد:N-جليكاناسيس (بنجاسيس، المفوضية الأوروبية 3.5.1.52) تطبق أيضا على نطاق واسع. المؤتلف و بنغازي (من فلافوباكتيريوم meningosepticum) هو الخيار الأكثر شيوعاً ويسمح بالإفراج عن جميع أنواع N-جليكانس، عدا الهياكل التي تحمل α1 الأساسية، فوكس 311،12. ولذلك يستخدم عادة ببنغازي (معزولة من بذور اللوز) لتحليل النبات N-جليكانس13. غير أن هذا الإنزيم ديجليكوسيلاتيس فقط بروتيوليتيكالي المستمدة من جليكوبيبتيديس، وهو غير قادر على ديجليكوسيلاتي جليكوبروتينس الأصلية14. ومن ثم، مطلوب من workup نموذج متعدد خطوة قبل مزيد من التحليل، الذي يتسبب في خسائر كبيرة في جليكانس، لا سيما تلك التي وفرة منخفضة15. والهدف العام للأسلوب تقديم سير العمل أمثل للإصدار-جليكان نوالأسفار التي وصفها بطريقة بسيطة وقوية. الأساس المنطقي هو أن ح بنغازي+، الذي تم اكتشافه مؤخرا في roseus تيريجلوبوس ويمكن التعبير عن ريكومبينانتلي في كولاي، يمكن أن يتحلل N-جليكانس مباشرة من السقالة البروتين في الحمضية 16من الشروط. مزايا رئيسية لاستخدام أكثر الأساليب البديلة من بنغازي ح+ أن ردود الفعل وضع العلامات الفلورية يمكن أن يؤديها في أنبوب رد الفعل نفسه دون تغيير في رد فعل المخازن المؤقتة17،18. شروط إعداد بسيطة والانتعاش عالية من oligosaccharides وفرة منخفضة تجعل هذا الأسلوب أداة قيمة في تحليل N-جليكانس. هذا البروتوكول مناسبة لتحليل N-جليكانس من مختلف الأنواع النباتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول وقد قدمنا هنا المقارنة بين الملامح-جليكان نمن أصناف شتى من الفجل. ميزة كبيرة لهذا الأسلوب مقارنة بالبروتوكولات القائمة أنه لا توجد تغييرات العازلة بين إطلاق سراح الانزيمية N-جليكانس ورد derivatization مع 2-آب مطلوبة. أن الخطوة الأكثر أهمية لهذا الإجراء هو تنقية N-جل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل جزئيا “مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية” (منح أرقام 31471703، A0201300537، و 31671854 إلى J.V. ول، منح عدد 31470435 G.Y.)، وهذه الخطة المواهب الأجنبية 100 (رقم المنحة JSB2014012 إلى J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
