ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H+
Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה הכנה וניתוח של N– glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus).
Abstract
בשנים האחרונות moieties פחמימות של צמחים קיבלו תשומת לב רבה, כפי שהם מקור פוטנציאלי של תגובות חיסוניות cross-reactive, מעורר אלרגיה. בנוסף, פחמימות מבנים גם לשחק תפקיד קריטי בחילוף החומרים הצמח. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה להכנה של ניתוח N– glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus) שימוש ספציפיים – glycanase Nלשחרור של פחמימות הצמחי מבנים. כדי להשיג זאת, פוחת משקעים חומצת חומץ טריכלור גולמי של צנון homogenates היו מטופלים עם PNGase H+, הנקרא באמצעות 2-aminobenzamide כמו תגית פלורסנט. הדגימות – glycan Nשכותרתו לאחר מכן נותחו על ידי ביצועים אולטרה לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה מבני נתונים היסטוריים והגליונות כרומטוגרפיה נוזלית (UPLC) הערכה כדי לכמת abundancies היחסית של המבנים נגזר צנון – glycan N. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לניתוח של N– glycans ממינים צמח שונים אחרים, עשוי להיות שימושי עבור חקירה נוספת של הפונקציה ואפקטים של N– glycans על בריאות האדם.
Introduction
N– glycans בצמחים יש משכו תשומת לב מוגברת בשנים האחרונות, כמו מחקרים קודמים הדגישה N– glycans כמקור פוטנציאלי אימונולוגי cross-reactions זה עלול לעורר תגובות אלרגיות1,2 . זה כבר הוכיחה בעבר כי N– glycans על הצמח glycoproteins יכול להשפיע על פעילות קטליטית3,4, thermostability,5,מתקפל6 או לוקליזציה subcellular ו הפרשת7. על מנת לתאם את המבנים glycan עם הפונקציות המתאימות שלהם, N– glycans חייב קודם להשתחרר מן glycoproteins כימית או enzymatically. שיטת כימי קלאסית עבור שחרור N– והן O– glycans היא β-חיסול, שבו מדגם אלקליין הטיפול מלווה הפחתה borohydride להניב alditol8. עם זאת, הליך זה מונע תיוג עם fluorophore וגורמת דעיכה משמעותית של יחידות חד-סוכר מהקצה תוך צמצום של המבנה glycan. Deglycosylation הכימי מבוסס על טיפול אמוניה מימית/פחמתי הוא גם נפוץ בשיטה חלופית9. אף אחת מהשיטות האלה שחרור כימי השתנה חלבונים שלמים, מה שמאפשר ניתוח spectrometric המוני של glycan ללא תווית בריכות ללא ההפרעה של פפטיד שברי בטווח מסה זהה. אולם, חסרון אחד השיטות האלה הוא קצב מוגבר השפלה α1, 3-fucosylated N– glycans, מבנה פחמימות משותף נמצאו צמחים10. לחלופין, שיטות פרסום אנזימטי באמצעות פפטיד:N– glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) חלים גם נרחב. F PNGase רקומביננטי (מתוך Flavobacterium meningosepticum) הבחירה הנפוצה ביותר, מאפשרת השחרור של כל סוגי N– glycans, למעט המבנים הנושאת של הליבה α1,11,3 fucose12. לכן, A PNGase (מבודד מזרעים שקדים) משמש בדרך כלל לניתוח של הצמח N– glycans13. עם זאת, deglycosylates אנזים זה רק proteolytically, נגזר glycopeptides, ואין אפשרות deglycosylate מקורי glycoproteins14. לפיכך, בדיקה רב שלבי מדגם נדרש לפני ניתוח נוסף, אשר גורם לאובדן נרחב של glycans, במיוחד אלה של שפע נמוכה15. המטרה הכוללת של השיטה היא להציג זרימת עבודה ממוטב עבור שחרור – glycan Nוזריחה תיוג באופן פשוט וחזק. הרציונל הבסיסי הוא כי PNGase H+, אשר נתגלה לאחרונה ב- Terriglobus ורודה , יכול להתבטא recombinantly ב e. coli, יכול hydrolyze N– glycans ישירות מתוך לגרדום חלבון בחומצי התנאים16. יתרון מפתח של שימוש PNGase H+ על שיטות אלטרנטיביות היא כי תגובות תיוג פלורסנט יכולה להתבצע בצינור התגובה אותו מבלי לשנות את התגובה מאגרי17,18. הכנה פשוטה תנאים ושחזור גבוה של oligosaccharides נמוך-שפע להפוך שיטה זו כלי רב ערך הניתוח של N– glycans. פרוטוקול זה מתאים לניתוח של N– glycans ממינים שונים של הצמח.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול שהוצגו כאן מאפשר השוואת הפרופילים – glycan Nשל הזנים השונים של צנון. יתרון משמעותי של שיטה זו לעומת פרוטוקולים הקיימת היא כי אין שינויים מאגר בין המהדורה אנזימטי של N– glycans התגובה derivatization עם 2-AB נדרשים. השלב הקריטי ביותר של ההליך הטיהור של N– glycans באמצעות העמודה SPE, כמו כשל ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי קרן מדעי הטבע של סין (גרנט מספרים 31471703, A0201300537 ו- 31671854 כדי לומר שראשי, להעניק מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (גרנט מספר JSB2014012 כדי לומר).
Materials
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
