Анализ N- гликанов от редька sativus сортов с использованием PNGase H+
Summary
Мы опишем простой и быстрый метод для подготовки и анализа N– гликанов из различных сортов редиса (редька sativus).
Abstract
В последние годы постановление углевод растений получили значительное внимание, поскольку они являются потенциальным источником cross-reactive, провоцируя специальные иммунных реакций. Кроме того структуры углеводов также играют критически важную роль в метаболизме растений. Здесь мы представляем простой и быстрый метод для подготовки и анализа N– гликанов из различных сортов редиса (редька sativus) с использованием N– glycanase, специфичных для выпуска растительного углеводов структур. Для достижения этой цели, сырой трихлоруксусной кислоты преципитаты редька гомогенатах были относиться с PNGase H+и помечены с помощью 2-aminobenzamide как флуоресцентные метки. Приклеенные этикетку N– glycan образцы впоследствии были проанализированы ультра производительность разделения жидкостной хроматографии (UPLC) и при содействии матрицы лазерной десорбции ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для подробного структурных оценки и количественного анализа относительной abundancies редиска производные N– glycan структур. Этот протокол может также использоваться для анализа N– гликанов из различных других видов растений и может быть полезной для дальнейшего расследования функции и N– гликанов воздействия на здоровье человека.
Introduction
N– гликанов в растениях привлекли повышенное внимание в последние годы, как предыдущие исследования высветил N– гликанов как потенциальный источник иммунологические перекрестные, которые могут вызвать аллергические реакции1,2 . Ранее было продемонстрировано, что N– гликанов на завод гликопротеинов может повлиять на каталитическую активность3,4, термостойкость и складной5,6 или субцеллюлярные локализации и секреция7. Для того, чтобы соотнести glycan структур с их соответствующих функций, N– гликанов сначала должен быть освобожден из гликопротеинов, химически или ферментативно. Классический химический метод для освобождения как N– и O– гликанов — β-ликвидация, в котором щелочной образца лечение сопровождается снижением с боргидрид приносить alditol8. Однако эта процедура не исключает маркировки с Флюорофор и вызывает значительный упадок моносахаридов единиц от снижения конца glycan структуры. Химических deglycosylation, основанный на Гидроксид аммония/карбонат лечения является также широко используется альтернативный метод9. Ни один из этих методов химического релиз деградирует интакт белками, который позволяет масс-спектрометрических анализ немеченого glycan бассейнов без вмешательства терпеноидные фрагменты из того же диапазона массы. Однако один недостаток этих методов встречается увеличение скорости разложения α1, N3-fucosylated – гликанов, общую структуру углеводов в растениях10. Кроме того, ферментативные релиз методы, используя пептиды:N– glycanases (PNGases, ЕС 3.5.1.52) также широко применяются. Рекомбинантных PNGase F (от флавобактерии meningosepticum) является наиболее распространенным вариантом и разрешает освобождение всех типов N– гликанов, за исключением структуры с учетом основных α1, 3 Фукоза11,12. Таким образом PNGase A (изолированные от миндаля семена) обычно используется для анализа растений N– гликанов13. Однако, этот фермент deglycosylates только proteolytically производные гликопептиды и не может deglycosylate родной гликопротеинов14. Следовательно перед дальнейшего анализа, который приводит к гибели гликаны, особенно низкой изобилие15требуется проработка многоступенчатой выборки. Общая цель метода – представить Оптимизированный рабочий процесс для N– glycan выпуска и флуоресценции маркировки на основе простой и надежный. Обоснование этого заключается PNGase H+, который был недавно обнаружен в Terriglobus roseus и recombinantly может быть выражен в E. coli, можно гидролизуют N– гликанов непосредственно из белка лески в кислой условия16. Ключевым преимуществом использования PNGase H+ над альтернативными методами является, что люминесцентные маркировки реакции может быть выполнена в том же реакция трубе без изменения реакции буферов17,18. Простая подготовка условий и высокое извлечение низкой изобилие олигосахариды делают этот метод является ценным инструментом в анализе N– гликанов. Этот протокол предназначен для анализа N– гликанов из различных видов растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, который мы представили здесь позволяет Сравнение профилей – glycan Nразличных сортов редиса. Значительное преимущество этого метода по сравнению с существующими протоколами является, что изменения буфера между ферментативные выпуск N– гликанов и деривации реакции с 2-AB…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали фонд естественных наук Китая (Грант номера 31471703, A0201300537 и 31671854 СП и л.л., предоставить г.я. номер 31470435) и 100 зарубежных талантов план (Грант номер JSB2014012 СП).
Materials
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
