Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ
Summary
Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.
Abstract
Met de stijgende prevalentie van neurodegeneratieve ziekten is het steeds belangrijker om te begrijpen van de onderliggende pathofysiologie, dat tot neuronale disfunctie en verlies leidt. Fluorescentie gebaseerde imaging tools en technologieën inschakelen ongekende analyse van subcellular neurobiologische processen, maar er nog behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen is voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies . We hebben een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie gebaseerde imaging studies met behulp van Drosophila modellen van neurodegeneratie ontwikkeld. Specifiek, beschrijven we een aanpak van het gemakkelijk-aan-volg, semi-geautomatiseerde Fiji/ImageJ met twee cellulaire processen te analyseren: ten eerste, we kwantificeren totale eiwitgehalte en profiel in de Drosophila optic kwab met behulp van fluorescentie-gelabeld mutant huntingtin eiwitten; en ten tweede, wij beoordelen autophagy-lysosoom flux in het visuele systeem van de Drosophila met ratiometric gebaseerde kwantificering van een tandem fluorescerende verslaggever van autophagy. Nog belangrijker is, bevat het protocol hier geschetste een semi-automatische segmentatie stap om ervoor te zorgen dat alle TL structuren worden geanalyseerd om te minimaliseren van selectie bias en om resolutie van subtiele vergelijkingen te verhogen. Deze aanpak kan worden uitgebreid voor de analyse van andere cel biologische structuren en processen betrokken in neurodegeneratie, zoals eiwithoudende puncta (stress korrels en synaptische complexen), zo goed als membraan-gebonden afdelingen (mitochondriën en membraan mensenhandel blaasjes). Deze methode biedt een gestandaardiseerde, maar aanpasbare referentiepunt voor beeldanalyse en kwantificering, en kon vergemakkelijken van betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid over het veld, en uiteindelijk mechanistische inzicht van neurodegeneratie vergroten.
Introduction
Neurodegeneratieve ziekten miljoenen mensen elk jaar en de incidentie neemt toe met een verouderende bevolking1. Terwijl elke neurodegeneratieve ziekte heeft een unieke etiologie, zijn aggregatie van eiwitten van de misfolded en de verdeling van het proteostasis-netwerk gemeenschappelijk pathologische kenmerken van veel van deze ziekten. Ophelderen hoe verstoring van deze fundamentele en onderling verbonden processen misgaat is om bij te dragen tot de neuronale cel en dysfunctie dood essentieel voor het begrip van neurodegeneratieve ziekten, alsmede het begeleiden van therapeutische interventies. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming voorziet in onderzoek van deze complexe en dynamische processen in neuronen en heeft bijgedragen aan ons begrip van de neuronale celbiologie. Analyse van fluorescently tagged eiwitten is uitdagend, met name wanneer de experimenten zijn uitgevoerd in vivo, als gevolg van de zeer compacte weefsels, diverse celtypes en morfologische heterogeniteit. Handmatig geassisteerde kwantificering is betaalbaar en eenvoudig, maar is vaak tijdrovend en onder voorbehoud van menselijke bias. Daarom is er behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies.
We hebben een eenvoudige en flexibele workflow met behulp van Fiji/ImageJ, een krachtige en vrij toegankelijke beeldverwerking software2,3, kwantitatieve om gegevens te extraheren uit imaging fluorescentiestudies in experimentele modellen van geschetst neurodegeneratie met behulp van Drosophila. Door het volgen van dit protocol om te kwantificeren aggregatie van eiwitten en autophagic flux — twee biologische functies die zeer relevant voor neurodegeneratieve ziekte pathologie zijn cel — we de gevoeligheid en de reproduceerbaarheid van deze aanpak aangetoond. Onderzoek van fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) eiwitten in de Drosophila optic kwab bleek het aantal, de grootte en de intensiteit van de eiwit-aggregaten. Wij een tandem fluorescerende verslaggever van autophagic flux binnen het visuele systeem van Drosophila , waarin verschillende emissie signalen afhankelijk van de compartimentaire omgeving4gevisualiseerd. Ratiometric gebaseerde analyse van de tandem verslaggever toegestaan voor een kwantitatieve en compleet beeld van autophagy-lysosoom flux van autophagosome formatie, rijping en vervoer tot degradatie in het lysosoom en daarnaast gemarkeerd kwetsbaar compartimenten verstoord in neurodegeneratieve omstandigheden. Nog belangrijker is, in beide analyses uitgevoerd we semi-geautomatiseerde drempelmethode en segmentatie stappen in ons protocol aan onbewuste bias te minimaliseren, vergroten van de macht van de bemonstering en bieden een standaard om vergelijkingen tussen soortgelijke studies. De eenvoudige werkstroom is bedoeld om krachtige Fiji/ImageJ plugins (ontwikkeld door informatici die zijn gebaseerd op wiskundige algoritmen) toegankelijker voor neurobiologists en de biowetenschappen Gemeenschap in het algemeen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier geschetste protocol kan worden gebruikt om krachtig en reproducibly kwantificeren cel biologische processen gevisualiseerd door fluorescentie gebaseerde imaging. Biologische context en technische beperkingen moeten zorgvuldig worden overwogen bij de proefopzet. Fluorescerende markers van subcellular structuren van belang, of immunohistochemische, kleurstof gebaseerde of genetisch uitgedrukt, moet worden onderscheiden boven achtergrond door morfologie en intensiteit. De UAS/GAL4 -systeem wordt veel gebrui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Sheila en David Fuente neuropatische pijn onderzoek programma Graduate Fellowship (naar J.M.B.), de Lois Pope LIFE Fellows Program (aan cl, Y.Z., en J.M.B.), de Snyder-Robinson Foundation predoctoraal Fellowship (naar cl), de Dr. John T . Macdonald Stichting (CL), contracten, subsidies van de National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 en R56NS095893 (voor R.G.Z.), en door Taishan geleerde Project (provincie Shandong, Volksrepubliek China) (R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. 유전학. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
