Количественные клеточной биологии нейродегенеративные у дрозофилы путем объективного анализа дневно тегами белков с помощью ImageJ
Summary
Мы разработали простой и адаптации рабочего процесса для получения количественных данных из ячейки на основе изображений флуоресценции биологических исследований агрегации белков и autophagic потока в центральной нервной системе дрозофилы моделей нейродегенеративные.
Abstract
С ростом распространенности нейродегенеративных заболеваний все более важно понять основные патофизиологии, что приводит к дисфункции нейронов и потери. На основе флуоресценции изображений инструменты и технологии позволяют беспрецедентный анализ субцеллюлярные нейробиологических процессов, пока сохраняется потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования . Мы разработали простой и гибкой рабочий процесс, чтобы извлекать из на основе флуоресценции изображений исследования с использованием модели дрозофилы нейродегенеративные количественные данные. В частности, мы описываем easy-to последующие, полуавтоматическое подход с использованием Фиджи/ImageJ для анализа двух клеточных процессов: во-первых, мы количественно совокупного содержания белка и профиль в доле зрительного дрозофилы , с помощью люминесцентной меткой мутант гентингтина белков; и во-вторых, мы оцениваем autophagy Лизосома потока в системе дрозофилы визуальные с количественной оценки на основе ratiometric тандем флуоресцентные репортер autophagy. Важно отметить, что изложенные здесь протокол включает полуавтоматическая сегментация шаг, чтобы убедиться, что все флуоресцентные структуры анализируются к минимуму систематическая и увеличить разрешение тонкие сравнений. Этот подход может быть продлен для анализа других клеток биологических структур и процессов причастны нейродегенеративные, таких как белковых puncta (гранулы стресс и синаптическую комплексы), а также мембраны прыгните отсеков (митохондрии и мембрана везикулы торговли людьми). Этот метод обеспечивает стандартизированный, но адаптированы ссылку для анализа изображений и количественной оценки и могли бы способствовать надежности и воспроизводимости через поле и в конечном итоге повысить механистического понимания нейродегенеративные.
Introduction
Нейродегенеративные заболевания затрагивают миллионы людей каждый год, и растет с старение населения1. Хотя каждый нейродегенеративные заболевания имеет уникальный этиологии, агрегирование смятых протеинов и разбивка proteostasis сети общих патологических отличительными особенностями являются многие из этих болезней. Разъяснение, как нарушение этих основных и взаимосвязанных процессов идет наперекосяк вносить нейрональных дисфункции и клеток смерть имеет решающее значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, а также руководящих терапевтических вмешательств. На основе флуоресценции изображений позволяет для расследования эти сложные и динамичные процессы в нейронах и внесла значительный вклад в наше понимание биологии нейрональные клетки. Анализ дневно тегами белков является сложной задачей, особенно когда эксперименты проводятся в естественных условиях, из-за весьма компактный тканей, типов различных клеток и морфологическая неоднородность. Вручную помощь количественной оценки является доступным и простым, но часто занимает много времени и при условии человека предвзятости. Таким образом существует потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования.
Мы разработали простой и гибкой рабочего процесса с помощью Фиджи/ImageJ, мощный и свободно доступных изображений, обработки программного обеспечения2,3, чтобы извлечь количественные данные из флуоресценции изображений исследования в экспериментальной модели нейродегенеративные используя дрозофилы. Следуя этот протокол для количественного определения белка агрегации и autophagic потока — две ячейки биологических особенностей, которые весьма актуальны для нейродегенеративные заболевания патология — мы продемонстрировали чувствительность и воспроизводимость этого подхода. Анализ дневно тегами мутант гентингтина (НТТ) белков в доле зрительного дрозофилы показали, число, размер и интенсивность белка агрегатов. Мы визуализирована тандем флуоресцентные репортер autophagic потока в пределах дрозофилы зрительной системы, которая отображает различные выбросов сигналов в зависимости от среды полигамное4. На основе Ratiometric анализа тандем репортер позволяет представление количественных и всеобъемлющей autophagy Лизосома потока от autophagosome формирования, созревания и транспорта к деградации в Лизосома и дополнительно выделены уязвимые отсеки в нейродегенеративных условий. Главное в обоих анализах мы реализовали полуавтоматические ограничивание и сегментация шаги в нашей протокол к минимуму бессознательного смещения, увеличения отбора мощности и установить стандарт для облегчения сопоставлений между аналогичные исследования. Простой рабочий процесс предназначен для мощных плагинов Фиджи/ImageJ (разработанных компьютерных ученых, основанные на математических алгоритмов) более доступными для neurobiologists и наук о жизни сообщества в целом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, изложенные здесь может использоваться для энергично и герметизации quantitate биологических процессов клетки визуализированы на основе флуоресценции изображений. Контекста биологических и технических ограничений необходимо тщательно направлять экспериментальный дизайн. Флу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Шейла и Дэвид Фуэнте нейропатической боли исследовательской программы стипендий (для J.M.B.), Лоис Папа Римский жизни стипендиатов программы (C.L., ВМФ и J.M.B.), лектор Стипендия фонда Снайдер-Робинсон (чтобы C.L.), д-р Джон T . Фонд Макдональд (чтобы C.L.), контракты, субсидии, полученные от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) HHSN268201300038C, R21GM119018 и R56NS095893 (R.G.Z.) и Тайшань ученый проекта (провинция Шаньдун, Китайская Народная Республика) (R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. 유전학. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
