Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per determinare quantitativamente il contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. La procedura di estrazione è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di alghe e cianobatteri; Tuttavia, a causa delle variazioni negli spettri di assorbimento del pigmento, è necessario testare individualmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.
Abstract
Si tratta di un semplice protocollo per la determinazione quantitativa del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Ficobiliproteine sono i componenti più importanti di ficobilisomi, le antenne di luce-raccolta principali nei cianobatteri e diversi taxa di alghe. I ficobilisomi di Synechocystis contengono due ficobiliproteine: ficocianina e allophycocyanin. Questo protocollo descrive una semplice, efficiente e un metodo affidabile per la determinazione quantitativa di ficocianina e allophycocyanin in questo cianobatterio modello. Abbiamo confrontato i diversi metodi di phycobiliprotein estrazione e quantificazione spettrofotometrica. La procedura di estrazione come descritto in questo protocollo è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di cianobatteri come Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., e Nostoc SP., anche per quanto riguarda le alghe rosse Porphyridium cruentum. Tuttavia, i coefficienti di estinzione di specifici ficobiliproteine da vari taxa possono differire e pertanto, si raccomanda di convalidare il metodo di quantificazione spettrofotometrica per ogni singolo ceppo individualmente. Il protocollo richiede poco tempo e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di scienze biologiche standard poiché si richiede attrezzature solo standard.
Introduction
fPhycobiliproteins sono complessi pigmento-proteina solubile in acqua che rappresentano i componenti principali delle antenne di luce-raccoglitrici in cellule procariotiche cianobatteri (Cyanophyta) e diversi taxa eucariotiche (Glaucophyta, Rhodophyta e Criptofite)1. Si presentano principalmente come complessi sopramolecolari chiamati ficobilisomi e sono in genere collegati alla superficie delle membrane fotosintetiche sul lato stromale, ad eccezione di Cryptophyta, dove sono localizzate le ficobiliproteine nella thylakoid lumen2. Sono stati identificati quattro tipi di ficobiliproteine fino a Data: allophycocyanin il nucleo e la periferica di ficocianina e ficoeritrina phycoerythrocyanin1. Come i complessi di raccolta di luce principali, ficobilisomi rappresentano uno dei fattori cruciali di produttività di massa colture di alghe e cianobatteri. È stato dimostrato che il troncamento ficobilisomi può migliorare accumulo di biomassa sotto forte luce3. D’altra parte, sotto modesto o basso irraggiamento, il troncamento dell’antenna ha provocato i tassi di crescita e biomassa accumulo riduzione3,4. Ficobiliproteine commercialmente sono utilizzati come coloranti per alimenti, prodotti farmaceutici e additivi alimentari, nell’industria cosmetica e come fluorescenza sonde con applicazioni in citometria a flusso, immunodosaggi fluorescente e di microscopia di fluorescenza5.
Questo protocollo è centrato sulla determinazione quantitativa di ficobiliproteine nel cianobatterio modello Synechocystis. I cianobatteri sono più presto autotrofi fotosintetici ossigenati; Essi hanno stato formando la biosfera terrestre per più di 2,4 miliardi di anni6. Giocano un ruolo cruciale nei cicli biogeochimici globali di azoto, carbonio, ossigeno e altri elementi. Tra i cianobatteri, un ceppo unicellulare Synechocystis guadagnato una posizione unica, poiché era il primo cianobatterio con l’intero genoma sequenziato7,8, è naturalmente trasformabile da DNA esogeno9, e esegue una crescita stabile e relativamente veloce10,11. In Synechocystis, il componente principale dell’antenna, allophycocyanin, è associato con le proteine integrali di membrana e la ficocianina annesso si trova alla periferia di membrana tilacoidale.
Diversi metodi per phycobiliprotein estrazione e quantificazione sono confrontati all’interno di questo protocollo. La procedura di estrazione finale è stata applicata con successo a Synechocystis, nonché ad altri ceppi di cianobatteri, tra cui Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.e di Nostoc SP. ed è stato applicato con successo anche alghe rosse Porphyridium cruentum. Pertanto, il metodo sviluppato in questo protocollo può essere considerato come un metodo universale per estrazione phycobiliprotein. Anche se alcuni dei metodi di estrazione testata ha provocato i rendimenti più elevati di proteina totale, qui descritta procedura di estrazione purché il phycobiliprotein più alto produce insieme con il più basso contenuto di clorofilla un residuo nella Estratto di Phycobiliprotein. Riduzione del contenuto di clorofilla un era essenziale per la corretta ficocianina e quantificazione spettrofotometrica allophycocyanin.
Gli spettri di assorbimento di phycobiliprotein può variare significativamente tra varie alghe e cianobatteri specie12,13,14,15,16,17 e anche tra i diversi ceppi di un genere di cianobatteri singolo18. Pertanto, le lunghezze d’onda specifiche e coefficienti di assorbimento come usato per la determinazione della ficocianina e allophycocyanin in Synechocystis non sono generalmente applicabili ad altri ceppi. Inoltre, Synechocystis non contiene ficoeritrina e phycoerythrocyanin che può essere trovato in alcune altre alghe e cianobatteri. Ai fini della determinazione di ficobiliproteine in ceppi diversi da Synechocystis, si raccomanda di valutare singolarmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.
Sebbene il protocollo contiene due passi più lunghi (una notte liofilizzazione del pellet cellulare ed estrazione della proteina 1 ora), il tempo di lavoro totale per la quantificazione di ficobiliproteine è non più di 2 ore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice, veloce e riproducibile per la quantificazione del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Diversi metodi di omogeneizzazione delle cellule, estrazione di proteine e quantificazione di ficocianina e allophycocyanin vengono confrontati e protocollo finale rappresenta una combinazione della procedura ottima di ogni singola procedura. Come dati rappresentativi, il contenuto di ficobiliproteine è stato quantificato in Synechocystis</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il protocollo è stato adottato da una precedente pubblicazione11. T. Z., ch. D. e J. Č. sono stati sostenuti dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e dello sport della Repubblica Ceca all’interno del programma di sostenibilità nazionale ho (NPU ho), concedere il numero LO1415. J. Č. fu appoggiato anche dal GA CR, concessione numero 18-24397S. Accesso a strumenti e altre strutture è stata sostenuta dall’infrastruttura di ricerca ceco per la biologia dei sistemi C4SYS (non progetto LM2015055). M. A. S. è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Fondazione scienza russa [n. 14-14-00904].
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
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