קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן כמותי phycobiliprotein בתוכן cyanobacterium Synechocystis באמצעות שיטת spectrophotometric. ההליך החילוץ היה הוחלו בהצלחה גם זנים אחרים כחוליות ואצות; עם זאת, בשל הבדלים ב ספקטרום בליעה פיגמנט, יש צורך לבחון את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.
Abstract
זהו פרוטוקול פשוט מצפני כמותית phycobiliprotein בתוכן מודל cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins הם המרכיבים החשובים ביותר של phycobilisomes, מחושיהם קציר-אור גדול של כחוליות מספר האצות taxa. Phycobilisomes של Synechocystis להכיל שתי phycobiliproteins: phycocyanin ו- allophycocyanin. פרוטוקול זה מתאר פשוט, יעיל, שיטה אמינה מצפני כמותיים הן phycocyanin והן allophycocyanin ב cyanobacterium מודל זה. אנחנו לעומת מספר שיטות החילוץ phycobiliprotein, spectrophotometric כמת. ההליך החילוץ כפי שמתואר פרוטוקול זה הוחל גם בהצלחה על זנים כחוליות אחרים כגון Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, ספירולינה sp., Arthrospira sp., Nostoc sp., כמו גם באשר אדומיות Porphyridium cruentum. עם זאת, המקדמים הכחדה של phycobiliproteins ספציפית של taxa שונים יכולים להיות שונים, ולכן, מומלץ כדי לאמת את שיטת כמת spectrophotometric עבור כל מאמץ יחיד בנפרד. הפרוטוקול דורש מעט זמן, ניתן לבצע במעבדה כל סטנדרט מדעי החיים שכן היא דורשת ציוד סטנדרטי בלבד.
Introduction
fPhycobiliproteins הם פיגמנטים מסיסים במים-חלבון מתחמי המייצגות רכיבים עיקריים של מחושיהם קציר-אור ב כחוליות prokaryotic (Cyanophyta), taxa מספר האיקריוטים (Glaucophyta, Rhodophyta , ו Cryptophyta)1. הם מתרחשים בעיקר בתור מתחמי סופרא מולקולרית בשם phycobilisomes, הם בדרך כלל מחוברים אל פני השטח של הממברנות פוטוסינתטיים בצד סטרומה, למעט Cryptophyta, איפה phycobiliproteins מותאמים תילקואיד לומן2. ארבעה סוגים של phycobiliproteins זוהו עד עדכנית: allophycocyanin את הליבה, וקו היקפיים phycocyanin, phycoerythrin ו- phycoerythrocyanin1. כמו מתחמי קציר-האור הראשי, phycobilisomes מייצגים את אחד הגורמים מכריע של פרודוקטיביות תרבויות מסת האצות, כחוליות. זה הוכח, שחיתוך phycobilisomes הזה יכול לשפר ביומסה הצטברות תחת אור חזק3. מצד שני, תחת irradiance צנוע או נמוך, העיגול אנטנה הביא שיעורי צמיחה ו-3,הפחתת הצטברות ביומסה4. Phycobiliproteins מסחרית משמשים צבעני מזון, תרופות, תוספי מזון, בתעשיית הקוסמטיקה, וכן קרינה פלואורסצנטית רגשים עם יישומים cytometry זרימה, immunoassays פלורסנט ו קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ5.
פרוטוקול זה מתמקד הקביעה כמותית של phycobiliproteins, cyanobacterium דגם Synechocystis. כחוליות הן המוקדם oxygenic פוטוסינתטיים autotrophs; הם יוצרים הביוספרה של כדור הארץ במשך יותר מ- 2.4 מיליארד שנה6. הם לשחק תפקיד מכריע הביוגיאוכימיים הכללית של חנקן, פחמן, חמצן ורכיבים אחרים. בין כחוליות, זן חד־תאיות Synechocystis השיגה תפקיד ייחודי מאז זה היה cyanobacterium הראשון עם הגנום כולו רציף7,8, זה מודולרי באופן טבעי על ידי ה-DNA אקסוגני9, ו היא מבצעת צמיחה יציבה ומהירה יחסית10,11. ב- Synechocystis, הרכיב אנטנה הליבה, allophycocyanin, קשורה עם החלבונים ממברנלי אינטגרלי, והוא phycocyanin המצורף ממוקם בפריפריה תילקואיד ממברנה.
מספר שיטות החילוץ phycobiliprotein, כימות מושווים בתוך פרוטוקול זה. ההליך הסופי החילוץ הוחלה בהצלחה אל Synechocystis, כמו גם זנים אחרים של כחוליות, כולל Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, ספירולינה sp., Arthrospira sp., ו Nostoc sp., והוא הוחל גם בהצלחה על אדומיות Porphyridium cruentum. לכן, השיטה פותחה ב פרוטוקול זה יכול להיחשב כשיטה אוניברסלי לחילוץ phycobiliprotein. אף-על-פי חלק מהשיטות החילוץ שנבדקו, גרמו תשואות גבוהות של חלבון הכולל, הכאן תיאר נוהל חילוץ בתנאי phycobiliprotein הגבוהה ביותר התשואות יחד עם התוכן הנמוך של כלורופיל משקע ב phycobiliprotein חלץ. הפחתת את התוכן של כלורופיל היה חיוני phycocyanin הנכון של כימות spectrophotometric allophycocyanin.
ספקטרום בליעה phycobiliprotein יכול להשתנות באופן משמעותי בין אצות כחוליות מינים12,13,14,15,16,17 שונים ואפילו בין זנים שונים של סוג כחוליות יחיד18. לכן, אורכי גל מסוים ואת מקדמי קליטה משמש לקביעת phycocyanin ו- allophycocyanin ב Synechocystis אינם חלים באופן כללי על זנים אחרים. בנוסף, Synechocystis אינו מכיל phycoerythrin ו- phycoerythrocyanin שניתן למצוא בין כמה אחרים אצות כחוליות. לצורך קביעת phycobiliproteins ב זנים שאינם Synechocystis, מומלץ להעריך את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.
למרות הפרוטוקול מכיל שני צעדים ארוכים יותר (בין לילה ליופיליזציה של כדורי הסלולר והפקת חלבונים שעה), הזמן העבודה הכוללת עבור כימות phycobiliproteins הוא לא יותר מ 2 שעות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור כימות של phycobiliprotein בתוכן מודל cyanobacterium Synechocystis. מספר שיטות תא המגון חלבון החילוץ, phycocyanin, allophycocyanin כמת מושווים, פרוטוקול הסופי מהווה שילוב של השלבים אופטימלית של כל נוהל בודדת. בתור נציג נתונים, התוכן של phycobiliproteins הייתה לכמת בתאים Synechocystis תחת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרוטוקול אומצה מן הפרסום הקודם11. ט Č צ, ד בח י. נתמכו על-ידי משרד החינוך, נוער וספורט של הרפובליקה הצ’כית במסגרת התכנית הלאומית הקיימות אני (NPU אני), להעניק LO1415 מספר. ג’יי Č. גם נתמך על ידי GA CR, גרנט מספר 18-24397S. לגישת מכשירים ומתקנים אחרים נתמכה על ידי תשתיות מחקר הצ’כי ביולוגיה מערכתית C4SYS (פרויקט אין LM2015055). מ א ס נתמך על ידי מענק של קרן המדע הרוסי [מס 14-14-00904].
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H., Green, B. R., Parson, W. W. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. , 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. . The Molecular Biology of Cyanobacteria. , (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V., Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. , 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., Gault, P. M., Marler, H. J., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. , 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
