Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Phycobiliprotein Inhalt in cyanobakteriums Synechocystis eine photometrische Methode quantitativ zu bestimmen. Extraktionsverfahren wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien und Algen Stämme angewendet; jedoch aufgrund von Variationen in Pigment Absorptionsspektren ist es notwendig, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu testen.
Abstract
Dies ist ein einfaches Protokoll für die quantitative Bestimmung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Phycobiliproteins sind die wichtigsten Komponenten des Phycobilisomes, das großen Licht-ernten Antennen in Cyanobakterien und einige Algen Taxa. Die Phycobilisomes Synechocystis enthalten zwei Phycobiliproteins: Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente, und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in diesem Modell Cyanobakterium. Wir haben mehrere Methoden der Phycobiliprotein Extraktion und spektralphotometrische Quantifikation verglichen. Extraktionsverfahren wie in diesem Protokoll beschrieben wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien Stämme wie Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., angewendet. und Nostoc SP., Rotalgen Porphyridium Cruentum. Jedoch die vom Aussterben bedroht-Koeffizienten der spezifischen Phycobiliproteins aus verschiedenen Taxa können unterschiedlich sein und es empfiehlt daher, die photometrische Quantifizierungsmethode für jede einzelne Belastung individuell zu validieren. Das Protokoll erfordert nur geringen Zeitaufwand und kann in jedem standard Life-Science-Labor durchgeführt werden, da es nur standard-Ausrüstung erfordert.
Introduction
fPhycobiliproteins sind wasserlösliche Pigment-Protein-komplexe, die Hauptkomponenten des Licht-ernten Antennen in prokaryotic Cyanobacteria (Cyanophyta) und mehrere eukaryotischen Taxa (Glaucophyta, Rhodophyta darstellen , und Cryptophyta)1. Sie kommen hauptsächlich als supramolekulare komplexe Phycobilisomes genannt und sie hängen in der Regel an die Oberfläche der photosynthetischen Membranen auf der Stromale Seite, mit Ausnahme von Cryptophyta, wo die Phycobiliproteins, in lokalisiert sind der Thylakoidmembran Lumen2. Vier Arten von Phycobiliproteins wurden auf dem neuesten Stand: die Kern-Allophycocyanin und die peripheren Phycocyanin, Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin1. Als die wichtigsten lichtsammelkomplexe repräsentieren Phycobilisomes eines der entscheidenden Faktoren der Algen und Cyanobakterien massenkulturen Produktivität. Es wurde nachgewiesen, dass diese Phycobilisomes Abschneiden Biomasse Akkumulation unter starkem Licht3verbessern kann. Auf der anderen Seite führte unter bescheidenen oder niedrigen Bestrahlungsstärke, die Antenne Abschneiden Wachstumsraten und Biomasse Akkumulation Reduktion3,4. Phycobiliproteins dienen im Handel als Lebensmittel-Farbstoffe, Pharma und Lebensmittel-Zusatzstoffe in der kosmetischen Industrie sowie Fluoreszenz Sonden mit Anwendungen in der Durchflusszytometrie, fluoreszierende Immunoassays und Fluoreszenz-Mikroskopie-5.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die quantitative Bestimmung der Phycobiliproteins in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Cyanobakterien sind die frühesten sauerstoffhaltige photosynthetischen Autotrophe; Sie haben die Biosphäre der Erde für mehr als 2,4 Milliarden Jahren6gebildet. Sie spielen eine entscheidende Rolle im globalen biogeochemischen Kreisläufe von Stickstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und anderen Elementen. Unter den Cyanobakterien, eine einzellige Sorte Synechocystis eine Alleinstellung gewonnen, da war es die erste Cyanobakterium mit dem gesamten Genom sequenziert7,8, ist es natürlich umwandelbar durch exogene DNA-9, und Es führt stabil und relativ schnelles Wachstum10,11. In Synechocystis, die Kernkomponente Antenne Allophycocyanin, die integraler Membranproteine zugeordnet ist und die beigefügten Phycocyanin befindet sich an der Thylakoidmembran Membran Peripherie.
Mehrere Methoden zur Phycobiliprotein Extraktion und Quantifizierung werden in diesem Protokoll verglichen. Die endgültige Extraktionsverfahren wurde erfolgreich Synechocystissowie andere Cyanobakterien Stämme, einschließlich Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira eingesetzt. SP., und Nostoc SP., und es wurde auch erfolgreich auf Rotalgen Porphyridium Cruentumangewendet. Daher kann die Methode entwickelt, die in diesem Protokoll als eine universelle Methode für die Extraktion von Phycobiliprotein betrachtet werden. Obwohl einige der getesteten Extraktionsmethoden Gesamtprotein Ertragssteigerungen geführt, die hier beschrieben Extraktionsverfahren vorausgesetzt ergibt sich die höchste Phycobiliprotein zusammen mit dem niedrigsten Inhalt von Chlorophyll ein Rückstand in der Phycobiliprotein zu extrahieren. Reduzierung des Gehalts an Chlorophyll ein war entscheidend für die richtige Phycocyanin und Allophycocyanin spektralfotometrische Quantifizierung.
Die Phycobiliprotein Absorptionsspektren können variieren erheblich zwischen den verschiedenen Algen und Cyanobakterien Arten12,13,14,15,16,17 und sogar unter mehrere Stämme von einem einzigen Cyanobakterien Gattung18. Daher sind die spezifischen Wellenlängen und Absorption Koeffizienten zur Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in Synechocystis verwendet nicht allgemein anwendbar auf andere Stämme. Darüber hinaus bietet Synechocystis keine Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin, die in einigen anderen Algen und Cyanobakterien gefunden werden können. Für die Zwecke der Bestimmung der Phycobiliproteins Stämme als Synechocystisempfiehlt es sich, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu bewerten.
Obwohl das Protokoll länger zweistufig (über Nacht von der zellulären Pellets und 1 Stunde Proteingewinnung Gefriertrocknung) enthält, ist die gesamte Arbeitszeit für die Quantifizierung der Phycobiliproteins nicht länger als 2 Stunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Verschiedene Methoden der Zelle Homogenisierung, Proteingewinnung und Phycocyanin und Allophycocyanin Quantifizierung werden verglichen und das endgültige Protokoll stellt eine Kombination der optimalen Schritte jedes einzelnen Verfahrens. Als repräsentative Daten wurde der Inhalt des Phycobiliproteins in Synechocystis Zellen unter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Protokoll wurde von einer früheren Veröffentlichung11angenommen. T. Z. D. ch. und J. Č. wurden gefördert durch das Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik im Rahmen des nationalen Programms Nachhaltigkeit ich (NPU ich), Nummer LO1415 zu gewähren. J. Č. wurde auch von GA CR, Grant-Nummer 18-24397S unterstützt. Zugang zu Instrumenten und anderen Einrichtungen wurde von der Tschechischen Forschungsinfrastruktur für Systembiologie C4SYS unterstützt (Projekt keine LM2015055). M. A. S. wurde durch einen Zuschuss aus der russischen Science Foundation [Nr. 14-14-00904] unterstützt.
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
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