Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis
Summary
Hier presenteren we een protocol om te phycobiliprotein inhoud in de cyanobacterium Synechocystis een spectrofotometrische methode kwantitatief te bepalen. De extractiemethode werd ook met succes toegepast op andere cyanobacteriën en algen stammen; wegens verschillen in pigment absorptiespectra is het echter noodzakelijk is om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk onderzoek.
Abstract
Dit is een simpel protocol voor de kwantitatieve bepaling van phycobiliprotein in het model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteïnen zijn de belangrijkste onderdelen van de phycobilisomes, het grote licht-oogst antennes in cyanobacteriën en verschillende taxa van de algen. De phycobilisomes van de Synechocystis bevatten twee phycobiliproteïnen: phycocyanin en allophycocyanin. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte en betrouwbare methode voor de kwantitatieve bepaling van zowel phycocyanin en allophycocyanin in dit model cyanobacterium. We vergeleken de verschillende methoden van phycobiliprotein extractie en spectrofotometrische kwantificering. De extractie procedure zoals beschreven in dit protocol was ook met succes toegepast voor andere cyanobacteriën stammen zoals Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., en Nostoc sp., alsmede over de rode algen Porphyridium cruentum. Echter de coëfficiënten uitsterven van specifieke phycobiliproteïnen van verschillende taxa kunnen verschillen en het is daarom aangeraden voor het valideren van de methode spectrofotometrische kwantificering voor elke één stam individueel. Het protocol vereist weinig tijd en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de wetenschap van het leven van de standaard aangezien het vereist alleen standaard uitrusting.
Introduction
fPhycobiliproteins zijn wateroplosbaar pigment-eiwitcomplexen die belangrijke componenten van de antennes licht-oogst in prokaryotische cyanobacteriën (Cyanophyceen) en diverse eukaryotic taxa (Glaucophyta, Rhodophyta vertegenwoordigen , en Cryptophyta)1. Ze ontstaan voornamelijk supramoleculaire complexen genaamd phycobilisomes en ze zijn meestal gekoppeld aan het oppervlak van de fotosynthetische membranen op de stromale kant, met uitzondering van Cryptophyta, waar de phycobiliproteïnen zijn gelokaliseerd in de thylakoïde lumen2. Vier soorten phycobiliproteïnen up-to-date zijn geïdentificeerd: de kern-allophycocyanin, en de perifere phycocyanin, phycoerythrin en phycoerythrocyanin1. Als de belangrijkste licht-oogst complexen vormen phycobilisomes een van de cruciale factoren van algen en cyanobacteriën massa culturen productiviteit. Het is aangetoond dat phycobilisomes afkappen biomassa accumulatie onder sterke licht3kunt verbeteren. Aan de andere kant onder bescheiden of lage bestralingssterkte resulteerde de antenne truncatie in groeicijfers en biomassa accumulatie vermindering3,4. Phycobiliproteïnen worden commercieel gebruikt als voedsel kleurstoffen, geneesmiddelen en additieven in de cosmetische industrie, en als fluorescentie sondes met toepassingen in stroom cytometry, fluorescerende immunoassay en fluorescentie microscopie5.
Dit protocol is gericht op de kwantitatieve bepaling van phycobiliproteïnen in het model cyanobacterium Synechocystis. Blauwalgen zijn de vroegste Oxygene fotosynthetische autotrophs; ze hebben de vorming van de aardse biosfeer voor meer dan 2,4 miljard jaar6. Ze spelen een cruciale rol in wereldwijde biogeochemische cycli van koolstof, stikstof, zuurstof en andere elementen. Onder cyanobacteriën, een eencellige stam Synechocystis een unieke positie verworven omdat het was de eerste cyanobacterium met het hele genoom sequenced7,8, het is natuurlijk gassamenstelling door exogene DNA9, en voert het stabiele en relatief snelle groei10,11. In Synechocystis, het kernonderdeel van antenne, allophycocyanin, is gekoppeld aan de integraal membraaneiwitten en de bijgevoegde phycocyanin bevindt zich in de periferie van de membraan thylakoïde.
Verschillende methoden voor de winning van de phycobiliprotein en kwantificering worden vergeleken in dit protocol. De definitieve extractiemethode werd succesvol toegepast voor Synechocystis, alsmede voor andere cyanobacteriën stammen, met inbegrip van Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., en Nostoc sp., en het was ook succesvol toegepast op rode algen Porphyridium cruentum. Daarom is de methode ontwikkeld in dit protocol kan worden beschouwd als een universele methode voor de extractie van de phycobiliprotein. Hoewel sommige van de geteste extractiemethoden in hogere totale proteïne opbrengsten resulteerde, de hier beschreven extractiemethode mits de hoogste phycobiliprotein levert samen met de laagste hoeveelheid chlorofyl een residu in de phycobiliprotein extract. Vermindering van de hoeveelheid chlorofyl een was essentieel voor de juiste phycocyanin en allophycocyanin spectrofotometrische kwantificering.
De phycobiliprotein absorptiespectra kan aanzienlijk verschillen tussen verschillende algen en cyanobacteriën soorten12,13,14,15,16,17 en zelfs onder de verschillende stammen van een enkele cyanobacteriën geslacht18. Dus, de specifieke golflengten en absorptie coëfficiënten zoals gebruikt voor de bepaling van phycocyanin en allophycocyanin in Synechocystis gelden niet in het algemeen aan andere stammen. Bovendien bevat geen Synechocystis phycoerythrin en phycoerythrocyanin die worden in sommige andere algen en cyanobacteriën gevonden kan. Met het oog op de bepaling van phycobiliproteïnen in stammen dan Synechocystis, is het aanbevolen om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk evalueren.
Hoewel het protocol bevat twee langere stappen (‘s nachts vriesdrogen van de cellulaire pellets en 1 uur eiwit extractie), is de tijd van de totale arbeid voor de kwantificering van phycobiliproteïnen niet dan 2 uur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en reproduceerbare methode voor de kwantificering van phycobiliprotein inhoud in de model cyanobacterium Synechocystis. Verschillende methoden van cel homogenisering, eiwit extractie en phycocyanin en allophycocyanin kwantificering worden vergeleken, en het laatste protocol is een combinatie van de optimale stappen van elke één procedure. Als representatieve gegevens, was de inhoud van phycobiliproteïnen gekwantificeerd in Synechocystis cellen onder toen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het protocol goedgekeurd van een eerdere publicatie11. T. Z., D. Ch. en J. Č. werden ondersteund door het ministerie van onderwijs, jeugd en sport van de Tsjechische Republiek binnen het nationale programma voor duurzaamheid ik (Binengrenzen ik), nummer LO1415 te verlenen. J. Č. werd ook ondersteund door GA CR, Grant nummer 18-24397S. Toegang tot instrumenten en andere faciliteiten werd gesteund door de Tsjechische onderzoeksinfrastructuur voor systeembiologie C4SYS (project geen LM2015055). M. A. S. werd gesteund door een subsidie van de Russische Science Foundation [nr. 14-14-00904].
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H., Green, B. R., Parson, W. W. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. , 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. . The Molecular Biology of Cyanobacteria. , (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V., Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. , 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., Gault, P. M., Marler, H. J., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. , 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
