ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析
Summary
走査型電子顕微鏡および NMR による脂質結合ネクロトーシス従来および共焦点の生細胞顕微鏡イメージングなどの MLKL を介した膜破断の法を述べる。
Abstract
ネクロトーシスはし、混合系統キナーゼのようなドメインの pseudokinase、MLKL の破裂や permeabilize 血しょう膜を活性化するタンパク質キナーゼ 3 (RIPK3) を相互作用する受容体の活性化によって引き起こされるプログラムされた細胞死経路.ネクロトーシスは自己免疫、感染症や心血管系疾患や脳卒中、神経変性、がんを含む複数の疾患に関連付けられている炎症経路です。ここでは、ネクロトーシス膜破裂の死刑執行人として MLKL を特徴付けるために使用できるプロトコルについて述べる。我々 はネクロトーシス従来および共焦点蛍光顕微鏡を用いた生細胞イメージングを用いた細胞およびプラズマへの細胞質から MLKL の再分配を一緒に明らかに電子顕微鏡を用いた固定細胞プロセスを視覚化します。血しょう膜の大きな穴の誘導の前に膜。MLKL を介したネクロトーシスの推定される変調器を識別するために脂質を用いた核磁気共鳴 (NMR) 分析体外を提案します。本法に基づき、特定定量的脂質結合の好みホスファチジルコリン イノシトールリン酸 (PIPs) 膜ターゲットとネクロトーシスに透過に必要な MLKL の重要なバインダーとしてします。
Introduction
ネクロトーシスの遺伝的要素を識別する生理・疾患1,2,3,4,の5ネクロトーシスの含意をテストするための動物モデルの使用を促進しています。RIPK3 または MLKL のノックアウト マウスは、そのネクロトーシスは人生3,6の必須ではないことを示唆開発および大人の恒常性で最小限の含意を持っていた。さらに、特定の種は動物7,8ネクロトーシスの非本質的な役割をサポート、RIPK3 または MLKL のいずれかの遺伝子を含まない。その一方で、研究室に誘導される様々 な病態とノックアウト動物モデルに挑戦、炎症、免疫、ウイルス感染9,10,ネクロトーシスの重要な役割が明らかに11,12。
ネクロトーシスは異なる免疫センサー信号によっていくつかの方法で実行されるすべての RIPK31,13,14の活性化に繋がる。アクティブな RIPK3 化順番 MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 をアクティブにし、、11,12,13,14,15,16,17,18。ほとんどが勉強した、おそらく最も複雑な方法は、RIPK3 の活性化につながる死受容体血管を結紮を分割するか apoptosis かネクロトーシス1を誘導するシグナル伝達複合体の下流の組成に基づくです。ネクロトーシスはすさまじいが好まれている RIPK1 を介したシグナル伝達機構と RIPK319,20の関与の結果です。この結果は、カスパーゼ 8、ベイでネクロトーシスを保持ネクロトーシスの推定される内因性阻害剤の薬理学的抑制遺伝的削除に簡単に優先されます。RIPK1 に結合し、RIPK3 がアクティブになります。ネクロトーシスをアクティブにする別の方法は、従事し、TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF)21を介して RIPK3 をアクティブにする Toll 様受容体 TLR3/TLR4 シグナル伝達を介してです。まだネクロトーシスで死ぬことの別の方法は、直接従事し、RIPK322をアクティブに DNA センサー台の活性化です。
MLKL N 末端ヘリックス バンドル (NB) ドメインと規制ブレース地域3によってリンクされている C 末端 pseudokinase ドメイン (psKD) から成る細胞内蛋白質であります。正常細胞の MLKL はどこ RIPK314と非アクティブな複合体であると考えられる細胞質にあります。ネクロトーシスの活性化は、psKD、および NB とブレースの3,15,23で可能性のある追加のサイトの活発化のループの MLKL の RIPK3 のリン酸化をトリガーします。リン酸化は、RIPK314から解離による MLKL の構造変化を誘導します。不十分な理解の構造変化は、psKD24からブレースを解放します。2 本のヘリックスが含まれ、ブレースは、C ターミナル螺旋形25推定三量体に MLKL の重合を仲介します。ブレースの N 末端ヘリックスは、膜透過24,26のために不可欠である NB ドメインを阻害します。分離、NB ドメインは細胞膜透過とネクロトーシス16,24,27を誘導するために十分です。NB の pro necroptotic 活性は、マウス胚性線維芽細胞 (mlkl-/- MEFs) MLKL 欠損で再構成されました。NB は優先的に従事するリン脂質ホスファチジルイノシトール 4, 5 二リン酸 (PIP2) 脂質結合ドメインです。ブレース重合が PIP2極性基24NB の弱い相互作用を介して細胞膜と MLKL の採用を促進する前記 MLKL の活性化の段階的な機構を提案する.膜では、NB は、PIP2のため非アクティブな MLKL 内のブレースによってマスクされます追加の高親和性結合サイトの規制の露出を経る。全体的にみて、PIP2と NB の複数の相互作用は、これらのイベントの分子メカニズムが解明されていないが膜の破断につながる不安定します。
ここで我々 はネクロトーシス24の死刑執行人として MLKL の機能を特徴付けるために使用する特定のメソッドを示しています。特に、我々 は MLKL, NB, ブレース (NBB) ブレース阻害によって規制されており膜破裂とネクロトーシスを誘発する強制二量体化してアクティブになることができますの最も最小限のドメインに焦点を当てます。強制薬物誘発性 FKBP を介した二量体化住セルイメージ投射とネクロトーシスになる細胞の電子顕微鏡観察のために結合した発現システムについて述べる。さらに、NBB フォスファチジルイノシトール (PIPs) との相互作用の in vitro NMR 分析を示す.
Protocol
Representative Results
Discussion
膜破断24の推定死刑執行人として MLKL に関与する、我々 を組み合わせた技術のためのプロトコルを提供します。MLKL を介したネクロトーシスを調節する制御ネットワークを解読する、に加えてこれらのテクニックがない独立して使用できる他適切な生物学的システムを特徴付けるため。実質的に言えば、これらのテクニックは、中-低スループット探索ツールです。
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
なし。
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
