Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis
Summary
Nous rapportons des méthodes de caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le MLKL en necroptosis y compris l’imagerie conventionnelle et confocale microscopie de cellules vivantes, microscopie à balayage électronique et liaison lipidique axée sur les NMR.
Abstract
Necroptosis est un chemin de mort cellulaire programmée déclenché par l’activation du récepteur interaction protéine kinase 3 (RIPK3), qui phosphoryle et active le pseudokinase domaine kinase similaire de lignée mixte, MLKL, à se rompre ou permeabilize de la membrane plasmique . Necroptosis est une voie inflammatoire associée à des pathologies multiples, y compris l’auto-immunité, maladies infectieuses et cardiovasculaires, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence et le cancer. Nous décrivons ici les protocoles pouvant servir à qualifier le bourreau de rupture de la membrane plasmique dans necroptosis MLKL. Nous visualisons le processus de necroptosis dans les cellules à l’aide d’imagerie de cellules vivantes par microscopie de fluorescence conventionnels et confocale et dans les cellules fixes à l’aide de la microscopie électronique, qui ensemble ont révélé la redistribution des MLKL du cytosol au plasma membrane avant induction de grands trous dans la membrane plasmique. Nous présentons en vitro analyse de résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’aide de lipides pour identifier des modulateurs putatifs de médiation MLKL necroptosis. Selon cette méthode, nous avons identifié quantitatives préférences de lipide-fixation et phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) comme liants critiques des MLKL qui sont requises pour le ciblage de la membrane plasmique et la perméabilisation dans necroptosis.
Introduction
Identifier les composantes génétiques de necroptosis a facilité l’utilisation de modèles animaux pour tester l’implication des necroptosis dans la physiologie et les maladies1,2,3,4,5. Ko de RIPK3 ou MLKL chez les souris avait une implication minimale dans l’homéostasie développement et adulte, ce qui laisse supposer que necroptosis n’est pas essentiel pour la vie3,6. En outre, certaines espèces ne contiennent pas de gènes soit RIPK3 soit MLKL, appuyant le rôle de non essentiels des necroptosis animaux7,8. En revanche, contester les modèles animaux Knock-Out avec diverses pathologies induites dans le laboratoire a révélé un important rôle de necroptosis dans l’inflammation, l’immunité innée et infection virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis peut être activé de plusieurs façons par la signalisation au moyen de capteurs de l’immunité innée différents, tous de qui se traduisent par l’activation de RIPK31,13,14. RIPK3 active à son tour phosphoryle et active MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Le plus étudié, et peut-être la manière plus complexe, conduisant à l’activation de RIPK3 implique mort récepteur ligature, qui bifurque basée sur la composition en aval des complexes de signalisation soit induire l’apoptose ou necroptosis1. Il s’ensuit des Necroptosis lorsque la signalisation par le biais de RIPK1 est favorisée et se traduit par l’engagement de RIPK319,20. Ce résultat est facilement favorisé lors de l’inhibition pharmacologique ou délétion génétique de la caspase 8, un inhibiteur endogène putatif de necroptosis qui garde necroptosis à la baie. RIPK1 lie et active RIPK3. Une autre façon d’activer necroptosis est par le biais de récepteurs Toll-like TLR3/TLR4 signalisation, qui s’engage et RIPK3 se déclenche grâce à TIR-domaine-contenant adaptateur induisant l’interféron β (FTBC)21. Encore une autre façon de mourir par necroptosis est par l’activation de la sonde ADN DAI, qui directement se livre et active RIPK322.
MLKL est une protéine cytosolique composée un domaine N-terminal de bundle (NB) hélice et un domaine de pseudokinase C-terminal (psKD) reliés par un renfort réglementaire région3. Dans les cellules normales, les MLKL se trouve dans le cytosol où il est censé être dans un complexe inactif avec RIPK314. L’activation de necroptosis déclenche la phosphorylation de RIPK3 de MLKL dans la boucle d’activation de la psKD et potentiellement d’autres sites dans le NB et orthèse3,15,23. La phosphorylation induit un changement conformationnel dans MLKL qui se traduit par une dissociation du RIPK314. Mal comprise des changements conformationnels libèrent l’accolade du psKD24. L’orthèse, qui contient 2 hélices, négocie l’oligomérisation de MLKL dans un trimère putatif à travers le d’hélice C-terminale25. L’hélice N-terminale de l’orthèse inhibe le domaine NB, qui est essentiel pour membrane perméabilisation24,26. Isolément, domaine NB est suffisante pour induire la perméabilisation de la membrane plasmique et necroptosis16,24,27. L’activité de pro-necroptotic de NB a été reconstituée dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en MLKL (mlkl– / – MEFs). NB est un domaine de liaison du lipide qui engage préférentiellement le diphosphate de phosphatidylinositol 4, 5 de phospholipides (PIP2). Nous avons proposé un mécanisme par étapes d’activation de MLKL, dans lequel oligomérisation orthèse facilite le recrutement de MLKL à la membrane plasmique via les interactions faibles du NB avec le PIP2 groupes polaires24. Au niveau de la membrane, le NB subit une exposition réglementée d’un site de liaison de haute affinité supplémentaires pour PIP2, qui est masqué par l’orthèse en MLKL inactif. Dans l’ensemble, les interactions multiples du NB avec PIP2 déstabilisent la membrane plasmique, conduisant à sa rupture, bien que le mécanisme moléculaire de ces événements n’ont pas été élucidés.
Ici, nous illustrons les méthodes spécifiques utilisées pour caractériser la fonction de MLKL comme bourreau de necroptosis24. En particulier, nous nous concentrons sur le domaine plus minime de MLKL, le NB et l’accolade (BNB), qui est réglementé par l’inhibition de l’orthèse et peut être activé par le biais de dimérisation forcée pour induire la necroptosis et la rupture de la membrane plasmique. Nous décrivons notre système d’expression inductible combiné avec forcée dimérisation FKBP-mediated médicamenteuse à l’imagerie de cellules vivantes et microscopie des cellules subissant necroptosis. En outre, nous illustrons notre analyse in vitro RMN des interactions de BNB avec phosphatidylinositols (PIPs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous fournissons des protocoles pour les techniques que nous avons combiné impliqué MLKL comme le bourreau présumé de rupture de la membrane plasmique24. En plus de déchiffrer le réseau de régulation qui régule induite par le MLKL necroptosis, ces techniques peuvent servir indépendamment pour caractériser d’autres systèmes biologiques adaptés. Concrètement, ces techniques sont des outils de découverte du milieu à faible débit.
Régulièrement, nous avo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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