Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis
Summary
Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.
Abstract
Necroptosis ist ein programmierter Zelle Tod Weg, ausgelöst durch die Aktivierung des Rezeptors Interaktion Proteinkinase 3 (RIPK3), die phosphorylates und aktiviert die gemischte Abstammung Kinase-ähnliche Domäne Pseudokinase, MLKL, Bruch oder permeabilize der Plasmamembran . Necroptosis ist eine entzündliche Weg mehrere Pathologien einschließlich Autoimmunität, infektiöse und Herz-Kreislauferkrankungen, Schlaganfall, Neurodegeneration und Krebs zugeordnet. Hier beschreiben wir Protokolle, die verwendet werden, um MLKL als der Henker der Plasmamembran Bruch in Necroptosis zu charakterisieren. Wir visualisieren den Prozess der Necroptosis in Zellen mittels live Cell Imaging mit konventionellen und konfokale Fluoreszenzmikroskopie und in festen Zellen mittels Elektronenmikroskopie, die zusammen die Umverteilung von MLKL aus dem Zytosol in das Plasma enthüllt Membran vor Induktion von großen Löchern in der Plasmamembran. Wir präsentieren in Vitro Kernspinresonanz (NMR) Analyse mit Lipiden, um vermeintliche Modulatoren des MLKL-vermittelten Necroptosis zu identifizieren. Basierend auf dieser Methode, identifizierten wir quantitative Lipid-verbindliche Präferenzen und Phosphatidyl-Inositol Phosphate (PIPs) als kritische Bindemittel der MLKL, die für die Plasmamembran targeting und Permeabilisierung in Necroptosis erforderlich sind.
Introduction
Identifizierung von genetischen Komponenten des Necroptosis hat die Verwendung von Tiermodellen, die Implikation des Necroptosis in Physiologie und Krankheit1,2,3,4,5testen erleichtert. Ko von RIPK3 oder MLKL bei Mäusen hatten minimal Implikation in Entwicklung und Erwachsenen Homöostase, was darauf hindeutet, dass diese Necroptosis nicht für wichtig Leben3,6. Darüber hinaus enthalten bestimmte Arten entweder RIPK3 oder MLKL Gene, Unterstützung der unwesentliche Rolle der Necroptosis in Tiere7,8. Auf der anderen Seite hat anspruchsvolle ko Tiermodellen mit verschiedenen Pathologien im Labor induziert eine wichtige Rolle bei Entzündungen, angeborene Immunität und Virusinfektion9,10, Necroptosis ergeben 11 , 12.
Necroptosis kann auf verschiedene Weise durch Signalisierung durch verschiedene angeborene Immunität Sensoren aktiviert werden alle die sich bei der Aktivierung von RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 wiederum phosphorylates und aktiviert MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Die meisten studierte, und vielleicht der komplexeste Weg, führt zu einer Aktivierung des RIPK3 beinhaltet Tod Rezeptor Ligatur, die gabelt basierend auf die nachgelagerten Zusammensetzung der Signalisierung komplexe entweder induzieren Apoptose oder Necroptosis1. Necroptosis entsteht, wenn durch RIPK1 Signalisierung begünstigt wird und zu Engagement von RIPK319,20 führt. Dieses Ergebnis ist leicht begünstigt auf pharmakologische Hemmung oder genetische Löschung von Caspase 8, eine vermeintliche endogener Inhibitor des Necroptosis, die Necroptosis in Schach hält. RIPK1 bindet an und aktiviert RIPK3. Eine weitere Möglichkeit, Necroptosis zu aktivieren ist durch Toll-Like-Rezeptoren TLR3/TLR4 Signaltechnik, die eingreift und aktiviert RIPK3 durch TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE)21. Noch ist eine andere Art zu sterben durch Necroptosis durch Aktivierung der DNA-Sensor DAI, der direkt eingreift und aktiviert RIPK322.
MLKL ist ein cytosolischen Protein, bestehend aus einer N-terminalen Helix-Bundle (NB)-Domäne und einer C-terminalen Pseudokinase Domäne (PsKD) durch eine regulatorische Klammer Region3verbunden. In normalen Zellen ist MLKL in das Zytosol gefunden wo es angenommen wird, in einem inaktiven Komplex mit RIPK314. Aktivierung des Necroptosis löst RIPK3 Phosphorylierung des MLKL in der Aktivierung der PsKD und möglicherweise weitere Standorte in der NB und Klammer3,15,23. Phosphorylierung bewirkt eine Konformationsänderung in MLKL, der Dissoziation von RIPK314führt. Schlecht verstandene Konformationsänderungen lassen Sie die Klammer aus dem PsKD24. Die Klammer, die 2 Helices enthält, vermittelt Oligomerisierung von MLKL in einem vermeintlichen Trimer durch die C-terminale Helix25. Die N-terminale Helix der Orthese hemmt die NB-Domäne, die für Membran Permeabilisierung24,26unerlässlich. Isoliert reicht die NB Domäne Permeabilisierung der Plasmamembran und Necroptosis16,24,27induzieren. Die Pro-Necroptotic-Aktivität der NB wurde in Maus einen Mangel an MLKL (Mlkl– / – MEFs) embryonalen Fibroblasten rekonstituiert. NB ist ein Lipid-bindende Domäne, die bevorzugt die Phospholipid-Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2) eingreift. Wir haben einen schrittweisen Mechanismus der Aktivierung des MLKL, wobei Klammer Oligomerisierung erleichtert die Einstellung des MLKL in der Plasmamembran über schwachen Wechselwirkungen der NB mit dem PIP2 polare Kopfgruppe24vorgeschlagen. An der Membran erfährt die NB geregelten Exposition eine zusätzliche High-Affinity-Bindungsstelle für PIP2, die durch die Orthese in inaktiven MLKL maskiert wird. Insgesamt destabilisieren mehrere Interaktionen der NB mit PIP2 der Plasmamembran zu seinen Bruch, obwohl der molekulare Mechanismus dieser Ereignisse sind nicht geklärt.
Hier zeigen wir spezifische Methoden verwendet, um die Funktion des MLKL als Vollstrecker des Necroptosis24charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die minimalsten Domain MLKL, NB und Klammer (NBB) die Klammer Hemmung unterliegt und durch erzwungene Dimerisierung induzieren Plasmamembran Bruch und Necroptosis aktiviert werden können. Wir beschreiben unsere induzierbaren Expressionssystems kombiniert mit erzwungenen drogeninduzierte FKBP-vermittelte Dimerisierung für live Cell Imaging und Elektronenmikroskopie der Zellen Necroptosis. Darüber hinaus zeigen wir unsere in-vitro- NMR-Analyse der Interaktionen der BNB mit Phosphatidylinositols (PIPs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir bieten Protokolle für Techniken, die wir zusammen als die vermeintliche Henker der Plasmamembran Bruch24MLKL verwickelt. Neben der Entschlüsselung der regulatorischen Netzwerk, das MLKL-vermittelten Necroptosis regelt, können diese Techniken unabhängig verwendet werden, andere geeignete biologische Systeme zu charakterisieren. Praktisch gesehen, sind diese Techniken Medium zu niedrigen Durchsatz Discovery-Tools.
Wir haben routinemäßig verwendet live Cell Imagi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keine.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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