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생물학

Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis

Published: August 07, 2018
doi:
10.3791/58088
, , , ,
1Department of Structural Biology,St. Jude Children’s Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics,St. Jude Children’s Research Hospital, 3Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.

Abstract

Necroptosis é uma via de morte celular programada desencadeada pela ativação do receptor interagindo proteína quinase 3 (RIPK3), que fosforila e ativa o pseudokinase quinase-como domínio de linhagem mista, MLKL, ruptura ou permeabilize a membrana plasmática . Necroptosis é uma via inflamatória associada com múltiplas patologias, incluindo a auto-imunidade, doenças infecciosas e cardiovasculares, acidente vascular cerebral, neurodegeneração e câncer. Aqui, descrevemos os protocolos que podem ser usados para caracterizar MLKL como o carrasco de ruptura de membrana plasmática em necroptosis. Visualizamos o processo de necroptosis nas células usando a imagem latente da viver-pilha com microscopia de fluorescência confocal e convencional e nas células fixas usando microscopia eletrônica, que juntos, revelou a redistribuição do MLKL do citosol para o plasma membrana antes da indução de grandes buracos na membrana plasmática. Apresentamos em vitro ressonância magnética nuclear (NMR) análise usando lipídios para identificar putativos moduladores de necroptosis MLKL-mediada. Com base neste método, identificamos quantitativas preferências de ligação de lipídios e fosfatos de fosfatidil-inositol (PIPs) como ligantes críticos do MLKL que são necessárias para direcionamento de membrana plasmática e permeabilização em necroptosis.

Introduction

Identificar componentes genéticos de necroptosis tem facilitado o uso de modelos animais para testar a implicação de necroptosis em fisiologia e doença1,2,3,4,5. Nocaute de RIPK3 ou MLKL em ratos teve implicação mínima na homeostase desenvolvimento e adulto, sugerindo que necroptosis não é essencial para a vida de3,6. Além disso, certas espécies não contêm genes ou RIPK3 ou MLKL, apoiando o papel de não-essenciais da necroptosis em animais7,8. Por outro lado, desafiar modelos animais nocaute com várias patologias induzidas em laboratório revelou um importante papel de necroptosis na inflamação, imunidade inata e infecção viral9,10, 11 , 12.

Necroptosis podem ser ativadas de várias maneiras por sinalização através de sensores diferentes imunidade inata, todos que se traduzam na ativação de RIPK31,13,14. RIPK3 ativo, por sua vez, fosforila e ativa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. O mais estudado, e talvez a forma mais complexa, levando à ativação de RIPK3 envolve a morte do receptor da ligadura, que bifurca com base na composição a jusante dos complexos sinalização também induzir apoptose ou necroptosis1. Necroptosis segue-se quando é favorecida e sinalização através de RIPK1 resulta em noivado de RIPK319,20. Este resultado é facilmente favorecido mediante inibição farmacológica ou exclusão genética de caspase 8, um inibidor endógeno putativo de necroptosis que fica necroptosis na baía. RIPK1 liga a e ativa RIPK3. Outra maneira de ativar necroptosis é através de receptores Toll-like TLR3/TLR4 de sinalização, que se envolve e ativa RIPK3 a TIR-domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF)21. Ainda outra forma de morrer por necroptosis é pela ativação do sensor DNA DAI, que diretamente se engaja e ativa RIPK322.

MLKL é uma proteína citosólica, composta de um domínio do N-terminal hélice bundle (NB) e um domínio de pseudokinase C-terminal (psKD) ligados por uma região reguladora chave3. Em células normais, MLKL é encontrado no citosol onde é pensado para ser um complexo inativo com RIPK314. Ativação de necroptosis desencadeia fosforilação de RIPK3 de MLKL no loop ativação do psKD e sites potencialmente adicionais no NB e cinta3,15,23. Fosforilação induz uma mudança conformacional na MLKL que resulta na dissociação do RIPK314. Mudanças conformacionais mal-compreendidos liberar a chave do psKD24. A joelheira, que contém 2 hélices, Medeia oligomerização de MLKL em um trímero putativo através do C-terminal hélice25. A hélice do N-terminal do contraventamento inibe o domínio NB, que é essencial para a membrana permeabilização24,26. Isoladamente, o domínio NB é suficiente para induzir a permeabilização da membrana plasmática e necroptosis16,24,27. A atividade de pro-necroptotic de NB foi reconstituída em fibroblastos embrionários de rato deficientes em MLKL (mlkl– / – MEFs). NB é um domínio de ligação de lipídios que envolve preferencialmente o difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Propusemos um mecanismo gradual de ativação do MLKL, no qual cinta oligomerização facilita o recrutamento de MLKL para a membrana plasmática através de interações fracas de NB com o PIP2 grupo cabeça polar24. Na membrana, o NB sofre exposição regulamentada de um site adicional de alta afinidade de ligação para PIP2, que é mascarada pelo contraventamento em MLKL inativo. Em geral, as várias interações de NB com PIP2 desestabilizam a membrana plasmática, levando a sua ruptura, embora o mecanismo molecular desses eventos não ter sido elucidado.

Aqui ilustramos métodos específicos usados para caracterizar a função do MLKL como executor do necroptosis24. Em particular, enfocamos o domínio mínimo do MLKL, NB e cinta (NBB), que é regulada pela inibição de contraventamento e pode ser ativadas através de dimerização forçada para induzir necroptosis e ruptura da membrana plasmática. Nós descrevemos o nosso sistema de expressão inducible combinado com forçada induzido FKBP-mediada dimerização para imagem latente da viver-pilha e microscopia eletrônica de células em fase necroptosis. Além disso, ilustramos nossa análise em vitro NMR das interações do NBB com phosphatidylinositols (PIPs).

Protocol

1. clonagem e geração de linha da pilha PCR amplificar a região do NBB, correspondente a resíduos de aminoácidos 1-140 (NBB140), do cDNA MLKL humano no quadro padrão baseada em enzimas de restrição clonagem com a proteína de ligação de oligomerização domínio 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) e fluorescentes de Venus proteína em doxiciclina (Dox) – inducible vetor retroviral pRetroX-TRE3G para obter o NBB140- 2xFV-Venus (tabela 1, figuras 1A-B). Imortaliza…

Representative Results

Visualizar regulamentados necroptosis execução em células vivas foi possível através da expressão inducible de uma construção mínima de MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Essa construção mantém a capacidade de induzir a permeabilização da membrana plasmática e é ativada através da oligomerização Dim-induzido da fita FKBP (2xFV). Observamos e quantificar necroptosis por microscopia de viver-pilha de imagem, monitoramento cineticamente (a cada 5 min), a absorç?…

Discussion

Nós fornecemos os protocolos para técnicas que nós combinamos implicados MLKL como o carrasco putativo de ruptura de membrana plasmática24. Além de decifrar a rede regulamentar que regula MLKL-mediada necroptosis, estas técnicas podem ser usadas independentemente para caracterizar outros sistemas biológicos adequados. Praticamente falando, estas técnicas são ferramentas de descoberta de médio para baixo-taxa de transferência.

Rotineiramente usamos imagem late…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nenhum.

Materials

Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3G Clontech 631188
Tet-On transactivator plasmid Llambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochloride Thermo Fisher Scientific BP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
Doxycycline Clontech 631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187 Takara 635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific S7020
Syto16 Thermo Fisher Scientific S7578
NMR
15N Ammonium Chloride Cambridge Isotope Laboratories NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTT Cambridge Isotope Laboratories DLM-2622-1
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace D310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) Avanti Polar Lipids 850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) Avanti Polar Lipids 850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOM Essen BioScience, Inc. Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam  Thermo Fisher Scientific Electron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) Essen BioScience, Inc. http://www.essenbioscience.com Imaging analysis
FEI MAPS Thermo Fisher Scientific https://www.fei.com/software/maps/ EM analysis
TopSpin v3.2 Bruker BioSpin http://www.bruker.com NMR data collection
CARA v1.9.1.7 http://cara.nmr.ch/  NMR data analysis
Slidebook 3i (Intelligent Imaging Innovations) https://www.intelligent-imaging.com/slidebook Confocal microscopy
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References

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Keywords: MLKLNecroptosisPlasma Membrane RuptureLive-cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid BindingMembrane TranslocationPermeabilizationMouse Embryonic FibroblastsDoxycyclineFK506-binding Protein DimerizerFluorescence MicroscopyCell Death Quantification
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McNamara, D. E., Quarato, G., Guy, C. S., Green, D. R., Moldoveanu, T. Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis. J. Vis. Exp. (138), e58088, doi:10.3791/58088 (2018).
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