Vi rapporterer metoder for kategorisering av MLKL-mediert plasma membranen brudd i necroptosis inkludert konvensjonelle og AC confocal live-celle mikroskopi bildebehandling, skanning elektronmikroskop og NMR-baserte lipid binding.
Necroptosis er en programmert celle død sti utløst av aktivering av reseptor samspill protein kinase 3 (RIPK3), som phosphorylates og aktiverer blandet herkomst kinase-lignende domenet pseudokinase, MLKL, brudd eller permeabilize plasma membranen . Necroptosis er en inflammatorisk veien tilknyttet flere patologi inkludert autoimmunitet, infeksjonssykdommer og hjerte, slag, neurodegeneration og kreft. Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å beskrive MLKL som bøddelen i plasma membranen brudd i necroptosis. Vi visualisere prosessen med necroptosis i celler ved hjelp av live-celle bildebehandling med fluorescens konvensjonelle og AC confocal mikroskopi og fast celler med elektronmikroskop, som sammen avdekket videreformidling av MLKL fra stoffer til plasma membran før induksjon av store hull i plasma membranen. Vi presenterer i vitro kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) analyse ved hjelp av lipider for å identifisere mulige modulatorer av MLKL-mediert necroptosis. Basert på denne metoden, identifisert vi kvantitative lipid-bindende preferanser og phosphatidyl-inositol fosfater (PIPs) som kritisk permer med MLKL som kreves for plasma membranen målretting og permeabilization i necroptosis.
Identifisere genetiske komponenter i necroptosis har muliggjort bruk av dyr modeller å teste Implikasjonen av necroptosis i fysiologi og sykdom1,2,3,4,5. Knockout av RIPK3 eller MLKL i mus hadde minimal konsekvensen i utvikling og voksen homeostase antyder at necroptosis ikke er avgjørende for liv3,6. Videre inneholder enkelte arter ikke enten RIPK3 eller MLKL gener, støtte ikke-essensielle rollen necroptosis i dyr7,8. På den annen side, har utfordrende knockout dyr modeller med ulike patologi indusert i laboratoriet avdekket en viktig rolle i necroptosis i betennelse, medfødt immunitet og viral infeksjon9,10, 11 , 12.
Necroptosis kan aktiveres på flere måter ved signalisering gjennom ulike medfødt immunitet sensorer, alle noe som resulterer i aktivering av RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 igjen phosphorylates og aktiverer MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. De studerte, og kanskje den mest komplekse måten, fører til aktivering av RIPK3 innebærer død reseptor ligation, som bifurcates basert på nedstrøms sammensetningen av signalnettverk komplekser å indusere enten apoptose eller necroptosis1. Necroptosis oppstår når signalisering gjennom RIPK1 foretrukket og resultater i engasjement RIPK319,20. Dette resultatet foretrukket lett farmakologiske hemming eller genetisk sletting av caspase 8, en antatte endogene inhibitor av necroptosis som holder necroptosis i sjakk. RIPK1 binder til og aktiverer RIPK3. En annen måte å aktivere necroptosis er gjennom Toll-like reseptorer TLR3/TLR4 signalnettverk, som engasjerer og aktiverer RIPK3 gjennom TIR domene-inneholder kort-inducing interferon-β (TRIF)21. Likevel er en annen måte å dø av necroptosis ved aktivering av DNA sensoren DAI, som direkte engasjerer og aktiverer RIPK322.
MLKL er en cytosolic proteiner som består av et N-terminal helix bunt (NB) domene og C-terminalen pseudokinase domene (psKD) koblet av en regulerende klammeparentes regionen3. I normale celler, er MLKL funnet i stoffer der det antas å være i en inaktiv kompleks med RIPK314. Aktivering av necroptosis utløser RIPK3 fosforylering av MLKL i aktiviseringen løkke av psKD og potensielt flere områder i de NB og spenne3,15,23. Fosforylering induserer en conformational endring i MLKL som resulterer i tar avstand fra RIPK314. Dårlig forstått conformational endringer release spenne fra psKD24. Spenne, som inneholder 2 helikser, formidler oligomerization av MLKL i en antatte trimer gjennom C-terminalen helix25. N-terminal helix av spenne hemmer NB domenet, som er avgjørende for membran permeabilization24,26. I isolasjon er NB domene tilstrekkelig til å indusere plasma membran permeabilization og necroptosis16,24,27. Pro-necroptotic aktiviteten til NB ble rekonstituert i mus embryonale fibroblaster mangelfull i MLKL (mlkl– / – MEFs). NB er et lipid bindende domene som fortrinnsvis engasjerer phospholipid phosphatidylinositol 4,5 diphosphate (PIP2). Vi foreslått en gradvis mekanisme for aktivering av MLKL, der klammeparentes oligomerization forenkler rekruttering av MLKL plasma membranen via svake interaksjoner av NB med PIP2 polar Hovedgruppe24. På membranen gjennomgår NB regulert eksponering av en ekstra høy affinitet bindende nettsted for PIP2, som er maskert av spenne i inaktiv MLKL. Samlet destabilisere flere samhandling NB med PIP2 plasma membranen fører til sine brudd, selv om den molekylære mekanismen av disse hendelsene ikke har utredet.
Her viser vi bestemte metoder benyttes for å karakterisere funksjon MLKL som bøddelen necroptosis24. Spesielt fokusere vi på det mest minimale domenet MLKL, NB og seler (NBB), som er regulert av klammeparentes hemming og kan aktiveres gjennom tvungen dimerization å indusere plasma membranen brudd og necroptosis. Vi beskriver induserbart uttrykk systemet kombinert med tvungen narkotikainduserte FKBP-mediert dimerization for live-celle bildebehandling og elektronmikroskop celler under necroptosis. I tillegg, viser vi vår i vitro NMR analyse av interaksjonene til NBB med phosphatidylinositols (PIPs).
Vi tilbyr protokoller for teknikker som kombineres til innblandet MLKL som antatte bøddelen plasma membranen ruptur24. I tillegg til tyde regulatoriske nettverket som regulerer MLKL-mediert necroptosis, kan disse teknikkene brukes uavhengig å karakterisere andre passende biologiske systemer. Praktisk talt, er disse teknikkene middels til lav-gjennomstrømming registreringsverktøy.
Vi har rutinemessig brukes live-celle bildebehandling på NBB140-2xFV-Venus-…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Cloning and cell line generation | |||
pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
NMR | |||
15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
Specialized Equipment | |||
IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
Software | |||
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |