Karakterisering av MLKL-mediert Plasma membranen brudd i Necroptosis
Summary
Vi rapporterer metoder for kategorisering av MLKL-mediert plasma membranen brudd i necroptosis inkludert konvensjonelle og AC confocal live-celle mikroskopi bildebehandling, skanning elektronmikroskop og NMR-baserte lipid binding.
Abstract
Necroptosis er en programmert celle død sti utløst av aktivering av reseptor samspill protein kinase 3 (RIPK3), som phosphorylates og aktiverer blandet herkomst kinase-lignende domenet pseudokinase, MLKL, brudd eller permeabilize plasma membranen . Necroptosis er en inflammatorisk veien tilknyttet flere patologi inkludert autoimmunitet, infeksjonssykdommer og hjerte, slag, neurodegeneration og kreft. Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å beskrive MLKL som bøddelen i plasma membranen brudd i necroptosis. Vi visualisere prosessen med necroptosis i celler ved hjelp av live-celle bildebehandling med fluorescens konvensjonelle og AC confocal mikroskopi og fast celler med elektronmikroskop, som sammen avdekket videreformidling av MLKL fra stoffer til plasma membran før induksjon av store hull i plasma membranen. Vi presenterer i vitro kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) analyse ved hjelp av lipider for å identifisere mulige modulatorer av MLKL-mediert necroptosis. Basert på denne metoden, identifisert vi kvantitative lipid-bindende preferanser og phosphatidyl-inositol fosfater (PIPs) som kritisk permer med MLKL som kreves for plasma membranen målretting og permeabilization i necroptosis.
Introduction
Identifisere genetiske komponenter i necroptosis har muliggjort bruk av dyr modeller å teste Implikasjonen av necroptosis i fysiologi og sykdom1,2,3,4,5. Knockout av RIPK3 eller MLKL i mus hadde minimal konsekvensen i utvikling og voksen homeostase antyder at necroptosis ikke er avgjørende for liv3,6. Videre inneholder enkelte arter ikke enten RIPK3 eller MLKL gener, støtte ikke-essensielle rollen necroptosis i dyr7,8. På den annen side, har utfordrende knockout dyr modeller med ulike patologi indusert i laboratoriet avdekket en viktig rolle i necroptosis i betennelse, medfødt immunitet og viral infeksjon9,10, 11 , 12.
Necroptosis kan aktiveres på flere måter ved signalisering gjennom ulike medfødt immunitet sensorer, alle noe som resulterer i aktivering av RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 igjen phosphorylates og aktiverer MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. De studerte, og kanskje den mest komplekse måten, fører til aktivering av RIPK3 innebærer død reseptor ligation, som bifurcates basert på nedstrøms sammensetningen av signalnettverk komplekser å indusere enten apoptose eller necroptosis1. Necroptosis oppstår når signalisering gjennom RIPK1 foretrukket og resultater i engasjement RIPK319,20. Dette resultatet foretrukket lett farmakologiske hemming eller genetisk sletting av caspase 8, en antatte endogene inhibitor av necroptosis som holder necroptosis i sjakk. RIPK1 binder til og aktiverer RIPK3. En annen måte å aktivere necroptosis er gjennom Toll-like reseptorer TLR3/TLR4 signalnettverk, som engasjerer og aktiverer RIPK3 gjennom TIR domene-inneholder kort-inducing interferon-β (TRIF)21. Likevel er en annen måte å dø av necroptosis ved aktivering av DNA sensoren DAI, som direkte engasjerer og aktiverer RIPK322.
MLKL er en cytosolic proteiner som består av et N-terminal helix bunt (NB) domene og C-terminalen pseudokinase domene (psKD) koblet av en regulerende klammeparentes regionen3. I normale celler, er MLKL funnet i stoffer der det antas å være i en inaktiv kompleks med RIPK314. Aktivering av necroptosis utløser RIPK3 fosforylering av MLKL i aktiviseringen løkke av psKD og potensielt flere områder i de NB og spenne3,15,23. Fosforylering induserer en conformational endring i MLKL som resulterer i tar avstand fra RIPK314. Dårlig forstått conformational endringer release spenne fra psKD24. Spenne, som inneholder 2 helikser, formidler oligomerization av MLKL i en antatte trimer gjennom C-terminalen helix25. N-terminal helix av spenne hemmer NB domenet, som er avgjørende for membran permeabilization24,26. I isolasjon er NB domene tilstrekkelig til å indusere plasma membran permeabilization og necroptosis16,24,27. Pro-necroptotic aktiviteten til NB ble rekonstituert i mus embryonale fibroblaster mangelfull i MLKL (mlkl– / – MEFs). NB er et lipid bindende domene som fortrinnsvis engasjerer phospholipid phosphatidylinositol 4,5 diphosphate (PIP2). Vi foreslått en gradvis mekanisme for aktivering av MLKL, der klammeparentes oligomerization forenkler rekruttering av MLKL plasma membranen via svake interaksjoner av NB med PIP2 polar Hovedgruppe24. På membranen gjennomgår NB regulert eksponering av en ekstra høy affinitet bindende nettsted for PIP2, som er maskert av spenne i inaktiv MLKL. Samlet destabilisere flere samhandling NB med PIP2 plasma membranen fører til sine brudd, selv om den molekylære mekanismen av disse hendelsene ikke har utredet.
Her viser vi bestemte metoder benyttes for å karakterisere funksjon MLKL som bøddelen necroptosis24. Spesielt fokusere vi på det mest minimale domenet MLKL, NB og seler (NBB), som er regulert av klammeparentes hemming og kan aktiveres gjennom tvungen dimerization å indusere plasma membranen brudd og necroptosis. Vi beskriver induserbart uttrykk systemet kombinert med tvungen narkotikainduserte FKBP-mediert dimerization for live-celle bildebehandling og elektronmikroskop celler under necroptosis. I tillegg, viser vi vår i vitro NMR analyse av interaksjonene til NBB med phosphatidylinositols (PIPs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi tilbyr protokoller for teknikker som kombineres til innblandet MLKL som antatte bøddelen plasma membranen ruptur24. I tillegg til tyde regulatoriske nettverket som regulerer MLKL-mediert necroptosis, kan disse teknikkene brukes uavhengig å karakterisere andre passende biologiske systemer. Praktisk talt, er disse teknikkene middels til lav-gjennomstrømming registreringsverktøy.
Vi har rutinemessig brukes live-celle bildebehandling på NBB140-2xFV-Venus-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
