פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.
סוג סבטיליזין/kexin proprotein convertase 9 (PCSK9) הוא פרוטאז יחיד-מחזור אשר מווסת את רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בסרום, וכתוצאה מכך מחלות לב וכלי דם. למרות PCSK9 proteolysis נדרשת עבור השפעתו hypercholesterolemic מלאה, הערכת פונקציית הפרוטאוליטי שלה הוא מאתגר: PCSK9 ידועה רק קליב עצמו עובר רק מחזור אחד, לאחר proteolysis, משמרת את המצע שלה ב אתר פעיל שלה כמו מעכב באופן אוטומטי. השיטות המובאות כאן לתאר וזמינותו אשר מתגבר על האתגרים הללו. הבדיקה מתמקדת proteolysis הבין-מולקולרי ההקשר מבוססת תא, המחשוף מוצלחות קישורים לפעילות לוציפראז המופרש, אשר ניתן בקלות לקרוא המדיום ממוזגים. דרך שלבים רציפים של מוטגנזה מכוונת, תרביות תאים ארעית של הבדיקה לוציפראז, וזמינותו יכול לחקור PCSK9 proteolysis בתנאים של ההפרעות גנטיות או מולקולרית באופן תפוקה גבוהה. מערכת זו היא מתאימה עבור הערכת בשני הביוכימי missense קלינית שהתגלו נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs), כמו גם באשר ההקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9 proteolysis.
PCSK9 מטרות קולטן LDL (LDL-R) עבור השפלה, העלאת הכולסטרול LDL (LDL-C) ונהיגה טרשת עורקים מחלות לב1,2. PCSK9 מיקוד הרפוי robustly להוריד את LDL-C, לשפר את התוצאות לב וכלי דם לחולים, אפילו בעת הוספת טיפול אגרסיבי להורדת שומנים בדם עם סטטינים3,4. אולם, כיום שאושרו טיפולים מוגבלות לנוגדן מבוססי גישות, סובלים מחוסר משתלמת5,6. כדי לפתור בעיה זו, פחות יקר חלופות טיפוליות, אמצעי לזיהוי חולים עשויה להרוויח יתרונות גדולים יותר, או שניהם, נדרשים.
גישות מולקולה קטנה יכולה מטרה תאיים PCSK9, מספקים נתיב משופרת של הממשל, לצמצם עלויות, שהופך אותם “הגביע הקדוש” זה באיזור7. עם זאת, PCSK9 הוכיח שקשה סמים על ידי מולקולות קטנות. כמו פרוטאז, מיקוד פונקציית הפרוטאוליטי של PCSK9 היא אסטרטגיית אטרקטיבי, כפי העצמי-proteolysis היא הצעד הגבלת קצב ההבשלה PCSK98 והוא נדרש לקבלת אפקט מקסימלי שלה ב- LDL-R9. עד כה, עם זאת, אסטרטגיה זו לא היה מוצלח, ככל הנראה בגלל הביוכימיה הייחודית של PCSK9: PCSK9 cleaves רק עצמו10, ביצוע תגובה אחת-מחזור, לאחר העצמי-המחשוף, PCSK9 prodomain כבולים בתוך האתר הפעיל כמו auto-מעכב11, מונע את המדידה של כל פעילות נוספת פרוטאז.
מאמר זה מציג שיטה להעריך פונקציית הפרוטאוליטי PCSK9 אופנה תפוקה גבוהה8. דרך מוטגנזה, חוקרים יכולים להשתמש assay הזה כדי לחקור את ההשפעות של קידוד SNPs נמצאו במרפאה כדי להעריך אותם על ההשפעות על proteolysis, השלב הגבלת קצב ההבשלה PCSK9. בנוסף, שיטה זו תהיה שימושית בעיצוב של מסכי תפוקה גבוהה לזיהוי מאפננים של PCSK9 proteolysis, אשר נמצאים צפוי בסופו של דבר לשבש את המצגת של PCSK9 ה-LDL-r (ו לווסת את אפקט hypercholesterolemic של PCSK9) . לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאים אחרים פרוטאזות עם פעילות מהותית נמוך, ובלבד i) זוג סובסטרט מסוים-פרוטאז ניתן למצוא, ii) עוגן תאיים מתאים יכול להתבסס על המצע.
ניסיוני בהליכים המתוארים לעיל להציג שיטה להתגבר על הפעילות נמוך מהותית הפרוטאז יחיד-מחזור PCSK9 ולהעריך את פונקציית הפרוטאוליטי בצורה איתנה. המושג מפתח וזמינותו נשענת על המרת אירוע יחיד-מחזור readout enzymatically מוגבר. נקודות החוזק של וזמינותו כוללים את מסגרת זמן קצר יחסית קלות השימוש של הכתב לוצי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים את התמיכה מימון נדיב מן NHLBI/NIH (K08 HL124068 ו- HMOT1243 אימייל), NCATS/NIH דרך UCSF קלינית Translational המדע מכון זרז לתוכנית (UL1 TR000004), הסנאט אקדמי UCSF, קרן הלמן, תודה גלעד מדעי מחקר מלומד פרס, פרס לב וכלי דם מתאווים פייזר (הכל אל חריפה ס ג’ון), הווארד יוז המכון הרפואי (ועד גיא טל מ Galvan וקוואן לשווקת מ’).
PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | 저자 | n/a | Available from authors |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | 저자 | n/a | Available from authors |
Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
(+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |